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人CGRP受体活性Gs蛋白复合物的冷冻电镜结构

原标题:人CGRP受体活性Gs蛋白复合物的冷冻电镜结构

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降钙素基因相关肽( CGRP )是一种广泛表达的神经肽,在感觉神经传递中具有重要作用。CGRP受体是降钙素受体样受体( CLR ) B类G蛋白偶联受体和1型跨膜结构域蛋白受体活性修饰蛋白1 ( ram P1 )的异二聚体。在此,我们报道了人CGRP受体与CGRP和Gs蛋白异三聚体的复合物的结构,通过伏打相板低温电子显微镜以3.3的全球分辨率测定。受体活性修饰蛋白跨膜结构域位于CLR跨膜结构域3、4和5之间的界面,稳定CLR胞外环2。ram P1仅与CGRP进行有限的直接接触,这与它在CLR变构调节中的功能一致。分子动力学模拟显示,ram P1为受体复合物提供稳定性,特别是在CLR胞外结构域的定位方面。这项工作为G蛋白偶联受体功能的控制提供了见解。

所有相关数据均可从作者处获得和/或包含在手稿或补充资料中。原子坐标和冷冻-电磁密度图已存放在编号为6e3y的蛋白质数据库和EMD - 8978条目的电子显微镜数据库中。

出版商注释:斯普林格自然对已出版地图和机构从属关系中的管辖权主张保持中立。

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这项工作得到了莫纳什大学Ramaciotti冷冻电子显微镜中心、澳大利亚国家卫生和医学研究理事会( NHMRC )项目赠款( 1120919 )和NHMRC项目赠款( 1055134 )的支持。中国科学院和中国科学院分别是国家海洋资源管理委员会的主要研究员和高级主要研究员。戴德华是NHMRC职业发展研究员,而陈凯是NHMRC CJ马丁研究员。ag .是澳大利亚研究委员会的DECRA研究员。博士是詹姆斯·库克研究员,得到马斯登基金(两者都是新西兰皇家学会)的资助。中华民国是皇家学会会员,并感谢BBSRC ( BB / M006883 / 1 )的支持。我们感谢赫里斯托普洛斯和朱立塔的分析和技术支持,感谢古德拉特对来自活性CTR的CLR进行了初步同源性建模,并感谢弗内斯、赵平和塔尔进行了有益的讨论。

大自然感谢卡隆、S、Dang、Wu和其他匿名评审者对这项工作的同行评审所做的贡献。

你-我l进行病毒生产、昆虫细胞表达、纯化、负染电镜、数据采集和分析,制备冷冻电镜样品,负责模型的建立和完善,并协助手稿的制备。m . k .进行了冷冻样品制备、相位板成像、数据收集、电子显微镜数据处理和分析,计算了冷冻EM图,并协助手稿制备。博士进行分子动力学模拟并协助手稿的准备。a .协助建立和完善模型,并协助编写文稿。科技部协助建立和完善模型,并审查手稿。凯克斯进行了基于细胞的分析和数据分析,并审阅了手稿。核磁共振对手稿进行了初步的低温扫描和审查。强生公司和世界银行组织并管理了伏打相板开发项目。博士提供了有关CGRP受体的见解,协助数据解释,并审阅了手稿。摩根士丹利提供了对B类GPCRs的见解,协助数据解释并审阅了手稿。交流协助资料解释和稿件准备。中情局设计分子动力学模拟,协助数据解释,并协助撰写手稿。邓文迪负责项目总体战略和管理、数据分析和解释,并协助撰写手稿。下午3 : 00负责项目总体战略和管理、数据解释和手稿撰写。

这些序列被注释以表示血凝素( HA )信号序列(红色高亮)、3C切割位点(灰色高亮)、标记(深橄榄绿高亮)和His标记(紫色高亮)的位置。天然蛋白质的取代序列列在构建序列上方并以蓝色突出显示。CLR和ram P1中的跨膜螺旋域用绿色框和高亮显示。冷冻- EM图谱中未被解析的蛋白质片段以黄色突出显示。模型中存在主链密度但侧链密度有限的氨基酸被剔除;这些在序列中显示为红色。

a、非标记CLR - ram P1 (野生型( WT ) CLR - ram P1 )和纯化构建体( HA - Flag - CLRand Flag - ram P1 )的药理学,在瞬时转染的COS - 7细胞中进行的CGRP介导的cAMP积累分析中。n = 5个独立实验,重复3次;数据为均值+标准差b,表达和纯化策略。c、复合物的最终大小排阻色谱洗脱曲线。d,SDS–大小排阻色谱峰的PAGE和考马斯蓝染色,显示复合物的每个组分的存在。

伏打相板复合体显微照片(代表3180部电影)。高对比度相位板成像有助于稳健的粒子选择,尽管粒子离焦低且堆积紧密。b、重新公布2D班平均成绩。c、地图细化工作流程。d、经过自动细化和锐化后,在RELION中计算出最终的3D冷冻EM图。e、金标准傅里叶壳相关曲线;总标称分辨率为3.26。f、模型过拟合是通过将所有原子随机移位0.5来评估的,并根据一个低温EM半图进行细化。计算所得模型与用于细化的半图(绿色)之间的傅立叶壳相关曲线;生成的模型和用于交叉验证的另一半图(红色),以及最终细化的模型和完整的图(蓝色)。g,与CLR的TM4和TM2碱基的潜在脂质相互作用。

显示了受体、CGRP肽(不包括map中未解析的lyp24 - Asn25 - Asn26序列)、斜坡跨膜结构域和每个斜坡ECD螺旋的所有7个跨膜螺旋和H8的冷冻- EM密度图和模型。R1 P1 H1侧链密度有限,侧链采用PDB : 4rw g12中R1 ECD的刚体拟合模型。还显示了Gαs - Ras结构域的N -末端(αH1 )和C -末端(αH5 )α-螺旋。上标P表示降钙素基因相关肽的残基。

由模拟的活性复合物形成的CLR (蓝带)和ram P1 (橙色带)的ECD骨架,以及由X射线晶体学12 (浅灰色带)求解的分离的CLR - ram P1 ECD复合物的结构。结构在ram P1 ECD上对齐。CLR循环(循环1 - 5 )被注释。CLR环1和环5序列在低温- EM图中未被解析,用黑色虚线箭头表示。CLR环4和5的主链位置的差异用蓝色(活性复合物)和灰色(孤立的ECD复合物)点箭头表示。CGRP肽的位置以暗红色显示。

CLR - CGRP - ram P1 - Gαβγ- Nb35 (黑色,2.4μs )、CLR - CGRP - ram P1 -Gα( 371 - 394 ) (紫色,2μs )和CLR - CGRP -Gα( 371 - 394 ) (蓝色,2μs )的模拟。一、中电发展区。b、CLR跨膜区。c、CGRP (叠加在T6 - S17上,因此对N端子半部有效)。一般来说,冷冻-电磁密度图中缺失的片段对应于高RMSF的区域,并且实际上拟合ECD作为一个整体的困难与其高RMSF ( a;补充视频2,3 )。ECD ( D55ECD - V63ECD )和( Q107ECD - g109 ECD )缺失的片段对应于离跨膜域最远的外环区域。尽管它们具有极性,但在分子动力学模拟中没有显示出持久的相互作用;D55ECD–V63ECD显示最大主干RMSF为8,而Q107ECD–g109 ECD显示同样高的RMSF为7.5。RMSF在a79 ECD - g81 ECD和p115 ECD - s117 ECD附近的次高峰值略低,但仍得到解决( a )。在跨膜域中,ICL3 ( h324 ICL3 - s328 ICL3 )和ECL3 ( p356 ec3 - e362 ec3 )都含有缺失残基,RMSF高于4.5 ( b )。尽管CGRP确实与ec3的近端(非缺失)区域相互作用,但在分子动力学模拟过程中,该区域没有显示出持久的相互作用。ICL 1 ( 3.6 )和ICL 2 ( 3.6 )的RMSF值较高,会产生残茬( K1672.40 )和e248 ICL 2–q250 ICL 2 ),但骨架已分解。对于CGRP,RMSF中残基26 ( c )周围的峰对应于外向环中不与CLR相互作用的三个高度可移动的外部残基( lyp24 - Asn25 - Asn26 ) (扩展数据图8 );这些残余物不能从电子密度来放置。这三个CGRP残基形成铰链,使得CLR ECD的取向发生改变,特别是在没有ram 1的情况下;RMSF值C - terminal越高,这是叠加策略和CLR的双域性质的产物,但它们的相对值仍然有效。一些细胞外环路的高活动性在视频中可见(补充视频1 - 3 )。

分子动力学模拟( 6.4μs )中ram P1和CLR之间的氢键。根据彩虹色标将总持久性绘制到实验结构上,其中从不涉及深蓝色的残留物和高度涉及红色的残留物。受体显示为粗大的条带,ramp 1显示为细色带,肽显示为细白带。显示了关键侧链,但对于间歇性氢键,旋转体状态已被修改以显示相互作用。形成相互作用网络的残基用相同的颜色标记。左侧,系统的总体拓扑。右上方,CLR跨膜域和ECD上部的放大图;右下方,在z轴上旋转90°的视图。参与ram P1 - CLR相互作用、R112R - E47ECD和D113R - t288e Cl2 / h289 ECL 2的氢键是显著的,因为它们连接跨膜结构域和ECD,并稳定ECL 2。与稳定CLR和ram P1 ECD相互作用有关的其他氢键包括S107R - e47 ECD、R102R - D55ECD、H97R - q50 ECD、D90R - y49 ECD、D71R - r38ed和E29R - r119 ECD。模拟过程中氢键持续存在的定量数据见补充表2。b、模拟过程中ram P1和CLR之间的接触( 6.4μs )。残基侧链的总持久性根据青色-栗色标度绘制在实验结构上,其中从未涉及青色的残基和高度涉及栗色的残基。肽(斜体、虚线)被描绘为细条带,而受体(实线)被显示为粗大条带和透明表面。左侧,系统的总体拓扑。右上角,涉及RAMP残基和CLR ECD、W59R、I63R、Y66R、H97R和I106R的最持久的相互作用有助于将αH3和αH2的C末端RAMP 1区域锚定到( CLR ECD的残基m42、t43 ECD、y46 ECD、y49 ECD、q50 ECD和m53 ECD )。右下角,ram P1和CLR的跨膜结构域之间最持久的疏水相互作用,即I123R、P126R、T130R、T134R和V137R (加上S141R )有助于将斜坡跨膜螺旋锚定到CLR ( TM3 - TM5;CLR残基y277 ecl2、h289 ecl2、A3005.45、I2353.52、F2624.52、L2584.48和W2544.44 )。

一、幼儿发展丙氨酸突变。CLR核心丙氨酸突变。突变的残基以x - stick格式显示。对信号无影响的突变残基呈灰白色。具有显著改变CGRP信号12、23、28、30、31、32、34、37、38的残基也在透明CPK表示中突出显示,根据效果的大小进行着色。黄色,< 10折;深橙色,10 - 100倍;红色,100 - 1000倍;黑色,> 1000倍。CLR和RAMP的主干(实线)显示在透明的灰白色色带中。CGRP肽(虚线)以x - stick格式表示,碳原子为暗红色,极性原子为红色或蓝色。

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