调控造血干细胞发生的长链非编码RNA

原标题:调控造血干细胞发生的长链非编码RNA

Cell Stem Cell 专家点评 | 兰雨/余佳/刘兵合作组首次揭秘调控造血干细胞发生的长链非编码RNA

点评丨程涛(中国医学科学院);单革(中国科学技术大学)

众所周知,造血干细胞 (Hematopoietic stem cell,HSC) 因其具有自我更新和多向分化潜能,可终生贡献机体所需的各类血细胞。小鼠胚胎发育早期,第一个具有长期重建成体造血系统潜能的HSC出现于胚胎期第10.5天(E10.5),其起源于多个血管位点,包括主动脉-性腺-中肾(AGM)区、头部和卵黄囊。近期一系列研究发现,AGM区主动脉腹侧的一群特化的血管内皮细胞,可通过内皮-造血转化,历经HSC前体(pre-HSC),最终生成HSC(图1)【1】。然而,HSC发育过程中,pre-HSC和HSC等关键细胞数量稀少,发育时间窗短,且缺乏特异性表面标志,对其精确研究异常困难。

图1. 小鼠胚胎造血细胞起源阶段及位点。胚胎造血分为3个阶段,其中定向造血(Definitive/HSC)主要发生在以AGM区为代表的多个位点,通过内皮-造血转化(EHT)产生HSC。(图片来源:Elaine Dzierzak and Anna Bigas, Cell Stem Cell, 2018, https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.04.015.)

针对HSC发育调控机制的多个研究显示,转录因子Runx1(及其下游靶基因Gfi1和Spi1)和Gata2等在内皮-造血转化中发挥着不可或缺的作用。信号通路如BMP/TGF-β、Notch和mTOR等均参与调控HSC的发生(图2)。迄今为止,非编码RNA在HSC发育中的动态表达全貌和生理功能仍不清楚。其中,长链非编码RNA(lncRNA)是一类长度大于200个核苷酸,几乎不具备蛋白质编码潜能的RNA分子,其可与核酸和蛋白质发生广泛相互作用来调节基因功能,在多种重要生命活动中发挥关键调控作用【2】。近期有研究发现骨髓HSC表达大量lncRNA,并鉴定出150余个骨髓HSC特异表达的未注释lncRNA,其中两个在维持HSC自我更新和分化中具有功能【3】。

图2. 造血干细胞发育的调控机制。(图片来源:Elaine Dzierzak and Anna Bigas, Cell Stem Cell, 2018, https://doi.org/10.1016/j.stem.2018.04.015.)

1月10日,暨南大学兰雨研究组、中国医学科学院余佳研究组、军事医学科学院附属医院(现为解放军总医院第五医学中心)刘兵研究组在Cell Stem Cell 杂志上发表了题为Combined Single-Cell Profiling of lncRNAs and Functional Screening Reveals H19 is Pivotal for Embryonic Hematopoietic Stem Cell Development 的研究。该研究在国际上首次绘制了小鼠胚胎HSC发育全程的单细胞lncRNA动态表达图谱,并结合体内外功能筛选鉴定出调控HSC发生的重要功能性lncRNA分子。

2016年,刘兵/汤富酬/袁卫平合作组在国际上首次采用单细胞孵育诱导移植,结合细胞表面标志CD201的特异性高表达,实现了pre-HSC高达30%成功率的高效捕获,同时联合单细胞转录组测序技术,系统揭示了HSC生命周期全程的分子表达规律【4】。基于以上单细胞转录组数据,该研究首次描绘出HSC发育全程的lncRNA动态表达图谱,并鉴定到一系列在HSC发育过程中全新未注释的lncRNA分子。深入分析了lncRNA与其邻近基因的表达关系,发现lncRNA与其邻近的第一个蛋白编码基因相关性更强,且他们的相对位置可能影响其调控关系。该研究进一步发现lncRNA相较于蛋白编码基因对于不同时空HSC相关群体的异质性具有更好的甄别度。最后通过与重要蛋白编码基因的基因座共定位或共表达分析对HSC发育全程动态变化的lncRNA进行了功能预测。

后续严格的生物信息学分析筛选获得一组潜在的功能性lncRNA,并通过体外功能实验发现6个可能在胚胎造血发育中发挥作用的lncRNA。利用条件基因敲除研究策略,着重阐明了lncRNA-H19对于AGM区HSC发生的重要作用。LncRNA-H19的缺失使得重要造血转录因子(包括Runx1及Spi1等)的启动子区域高甲基化并下调其表达,以致血管内皮细胞向pre-HSC的转化阻滞。机制研究发现胞浆定位的lncRNA-H19部分通过抑制甲基化调控分子SAHH的活性来调控目的基因的甲基化水平【5】,并且该调控功能与H19作为microRNA前体(pri-miR)可能加工产生的产物mir-675无关。而先前研究报道mir-675分子通过调控Igf1r-Igf2信号通路来维持成体HSC的静息状态【6】。

综上,该研究首次揭示了在HSC发生过程中发挥重要功能的lncRNA,并系统阐述了lncRNA-H19在胚胎HSC发生与成体HSC稳态维持中完全不同的功能以及调控方式。这些认识将为全面理解lncRNA调控重要生物学过程的机制提供重要启示,HSC发育全程的单细胞lncRNA图谱也将为HSC发育和再生机制研究提供重要的数据库和参考(图3)。

图3. 单细胞lncRNA图谱构建及H19作用机制模式图

军事医学科学院附属医院(现为解放军总医院第五医学中心)副研究员周杰、博士研究生张琳琳,中国医学科学院基础医学研究所博士后徐嘉悦、副研究员马艳妮、博士研究生刘思琪为该研究论文的第一作者。兰雨研究员、余佳研究员、刘兵研究员为该论文的通讯作者。

专家点评

程涛(中国医学科学院教授、教育部"长江学者",国家"杰青")

造血干细胞是已经被证实具有确切临床治疗价值的最经典的一类成体干细胞。造血干细胞的体外扩增和基因操作是进一步拓展诸如脐带血造血干细胞临床应用和开展地贫等基因治疗的先决条件。破解造血干细胞体外操作这样一个难题的根本生物学途径之一,就是从发育的角度认识造血干细胞的来龙去脉。因此深入研究造血干细胞的起源以及发育的路径,就显得极为重要。

兰雨/余佳/刘兵等联合团队在以往扎实的工作基础上,利用刘兵/汤富酬团队两年多前发表于Nature的高质量的单细胞转录组测序数据,首次在单细胞尺度描绘了内皮细胞、造血干细胞前体、定向造血干细胞以及胎肝造血干细胞等不同阶段造血干细胞的长链非编码RNA表达谱,找到了众多可能具有潜在功能的调控分子。

有趣的是他们发现了H19这个印记基因的lncRNA变化最为显著,进而证实了H19-lncRNA对于AGM造血干细胞的功能具有重要的调控作用,其部分作用是通过影响定向造血的两个著名转录因子,Runx1和Spi1。因此该工作揭示了造血干细胞发育的一个重要的表观调控机制,为将来造血干细胞体外扩增和基因修饰提供了新的分子干预靶点。

在这个重要的工作基础上,进一步了解H19的作用网络、Runx1以外的分子调控机制、其他众多lncRNA对造血干细胞发育的影响、最后明确这些分子在人类造血干细胞发育中起了什么作用,是将来重要的研究方向。

程涛教授

中国医学科学院血液病医院(血液学研究所)常务副所院长,实验血液学国家重点实验室主任,北京协和医学院干细胞与再生医学系创始主任,中国生理学会血液生理专业委员会创始主任委员。国际实验血液学会唯一中国理事及其会刊Experimental Hematology副主编,血液学国际权威杂志Blood首位中国编委。

程涛教授从事血液学专业30余年,是我国造血干细胞生物学的领军学者。国家重大科学研究计划(973)和重点研发任务首席科学家,基金委国家“杰出青年基金”、重大项目以及“创新研究群体”负责人。教育部和科技部创新团队带头人。获“千人计划”国家特聘专家、“长江学者”特聘教授、“百千万人才工程”国家级人选、“有突出贡献”中青年专家等荣誉。

多年来,其研究团队针对造血再生这一难题,围绕造血干细胞(HSC)的数量、质量和微环境的调控及恶变机制进行了长期而系统的研究,取得了一系列原创性成果,为HSC体外扩增、提高HSC体内再生效率和遏制白血病细胞生长提供了新策略,具有重要临床应用前景。研究成果在Science、Nature Medicine、Nature Genetics、Nature Cell Biology 等期刊发表论文200余篇,SCI文章平均影响因子8.5,谷歌学术查引9500余次(SCI5000余次)。获授权专利11项。主编和参编专著中文3部、英文6部,对造血及干细胞生物学的发展具有重要的学术贡献和影响。

单革(中国科学技术大学生命科学学院,教授,国家“杰青”)

长链非编码RNA研究的一个重要命题是长链非编码RNA(lncRNA)的时空表达及生理功能。兰雨/余佳/刘兵研究组合作发表在Cell Stem Cell上的论文,利用单细胞RNA测序(RNA-seq)数据描绘了7000多个在小鼠HSC (Hematopoietic stem cell,造血干细胞) 发育全程的lncRNA动态表达图谱,进而筛选出并详细研究了H19这一长链非编码RNA调控HSC发生的生理功能。

作者首先对六个HSC相关细胞群的单细胞测序数据进行了系统的生物信息学分析,从中发现了7300多个lncRNA,并且分析了它们的时空表达、与mRNA表达相关性、以及进化保守性等特点。非常有意思的是,lncRNA比mRNA具有更强的细胞特异性,暗示lncRNA在HSC相关细胞群时空分化上具有重要功能。尤其值得一提的是,作者还发现这七千多个lncRNA中,有400余个是未有注释的(unannotated),说明即使在RNA测序已经盛行多年的情况下,像HSC相关细胞群这样稀有的细胞类型中依然存在数量可观的未知lncRNA。

随后作者用以下三个标准分析筛选得到10个lncRNA:(1)从EC(早期胚胎中产生HSC相关细胞群的vascular endothelial cells)到T1 pre-HSC(第一类HSC前体细胞,CD45- type 1 precursors)被上调表达的;(2)属于pre-HSC指征(signature)lncRNA;(3)在至少三个物种中保守。进一步利用shRNA(short hairpin RNA)在原代细胞中敲低这10个lncRNA,发现其中H19的敲低对AGM(aorta-gonad-mesonephros)来源的CD31+细胞(其中包含几乎所有HSC相关前体细胞群)增殖分化的负面影响最大。

H19是生物学家早在1990年即发现的、也是第一个被发现的长链非编码RNA【1】。将近30年的研究已经发现H19具有多种生理功能及相关功能分子机理。H19既可以作为lncRNA也可以作为microRNA的前体产生miR-675来行使调控功能,并且与基因印记(imprinting)、多种肿瘤、数种人类疾病相关。兰雨/余佳/刘兵研究组随后利用H19条件敲除小鼠、在胚胎发育早期研究H19敲除之后对HSC相关细胞群的影响。结果证实、H19确实对AGM区HSC的发生起到必不可少的作用。在分子机理上,H19通过抑制SAHH(S-Adenosylhomocysteine hydrolase)来影响重要造血转录因子的启动子区域甲基化,从而调控血管内皮细胞向pre-HSC的转化。作者还通过多组实验表明H19的这一调控功能与其作为的microRNA前体而可能产生的miR-675没有关系。这一研究让人领悟到即使像H19这样已被非常详尽研究的lncRNA,依然可能具有重要的未知生理功能;而且暗示其它microRNA前体也有可能以长链非编码RNA的形式行使不依赖于其产生microRNA的功能。

兰雨/余佳/刘兵研究组这一工作非常好地利用了单细胞测序的特点和长处、扩展了我们对干细胞尤其是HSC相关细胞群中长链非编码RNA时空表达及生理功能的认知,也为该领域的进一步研究提供了资源(resource)和范式(paradigm)。

1. Brannan CI, Dees EC, Ingram RS, Tilghman SM. The product of the H19 gene may function as an RNA.Mol. Cell. Biol. 10 (1), 28–36 (1990).

单革教授

中国科学技术大学生命科学学院教授。1995年兰州大学细胞生物学学士,1998中科院上海细胞所硕士,2004年美国佐治亚州立大学博士。先后在美国爱默蕾(Emory)大学和耶鲁大学(导师Sidney Altman,RNA酶的发现人之一、1989诺贝尔化学奖)进行博士后研究。2010年进入中国科学技术大学工作。单革博士长期从事基因表达调控和非编码RNA功能及功能机理方面的研究。发现了新的非编码RNA类型(EIciRNA、5S-OT、ASAT siRNA、tiny RNA、p53点突变适配体RNA等)、研究了新的非编码RNA功能、揭示了新的非编码RNA作用机理、探索了新的非编码RNA研究方法。实验室成立以来先后在Genome Biology, Developmental Cell,Nature Structural & Molecular Biology,Nature Communications 和 PNAS等期刊发表多篇非编码RNA领域的研究论文。先后获得科技部“中青年科技创新领军人才”(2016),基金委“国家杰出青年基金”(2017),国家“万人计划”科技创新领军人才(2018)。

通讯作者简介

兰雨博士

暨南大学基础医学院研究员,博士生导师。2017年广东省“珠江人才计划”引进创新创业团队带头人,中国生理学会血液生理学专业委员会青年委员。研究方向:血管及血液系统发育。主要基于条件基因敲除及系列单细胞技术,进行血管及血液系统发育的规律及谱系分析,探索重要信号通路在血管及血液系统发育和疾病中的功能和机制。作为负责人先后承担国家重点研发计划课题,国家自然科学基金委重大项目(课题)、重大研究计划(培育项目)、面上项目等。发表SCI收录论文20余篇,通讯作者研究论文发表在Cell Stem Cell、Developmental Cell、Cell Research、Circulation Research、Blood 等杂志。论文引用1000余次(Google Scholar),3篇第一/通讯作者研究论文被FACULTY of 1000推荐。科研成果曾获得国家自然科学二等奖(2012年,排名第4)。

余佳研究员

中国医学科学院基础医学研究所RNA与干细胞生物学研究组长,北京协和医学院&中国医学科学院首批长聘教授,国家杰出青年科学基金获得者(2017),长江学者奖励计划入选者(青年,2017),中国医学科学院RNA与造血调控研究重点实验室主任,医学分子生物学国家重点实验室PI。研究方向为“RNA与干细胞功能”,阐明:非编码RNA基因簇在胚胎干细胞和造血干细胞谱系分化中的重要作用;LncRNA在造血干细胞发生过程的重要功能;非编码RNA加工对造血干细胞谱系命运决定的调控机理。作为负责人承担国家自然科学基金委重大研究计划、重点项目及科技部973子课题。近5年来在Cell Stem Cell、Nature Medicine、Nature Communications、EMBO Journal、Cell Research、Cancer Research、Nucleic Acids Research、Autophagy 等国际学术期刊上发表SCI论文20余篇,总引用2000余次。目前担任全国血液生理专业委员会委员,北京市生化协会青年委员会主任、理事,全国实验血液学青年委员会副主任。部分成果获得教育部2018年自然科学二等奖。

刘兵研究员

解放军总医院第五医学中心(原军事医学科学院附属医院)肿瘤学研究室主任。研究方向聚焦“基于造血干细胞发育规律建立再生新策略”,陆续取得多个科学发现,包括:国际上首次在单细胞尺度实现造血干细胞发育全程的深度解析;阐明LncRNA在造血干细胞发生过程的重要作用;揭示小鼠胚胎头部是造血干细胞发育的新位点;阐明造血干细胞起源的功能异质性。近五年承担国家杰出青年科学基金、国家重点研发计划等项目,入选国家科技部创新领军人才、万人计划等,以通讯作者在Nature、Cell Stem Cell、Blood 等杂志发表多篇学术论文,其中3篇被F1000推荐。培养的博士研究生荣获2016年度吴瑞奖(The Ray Wu Prize)。

原文链接:https://www.cell.com/cell-stem-cell/fulltext/S1934-5909(18)30559-9

参考文献

1. Dzierzak E & Bigas A. Blood development: hematopoietic stem cell dependence and independence. Cell Stem Cell, 22(5), 639-651 (2018).

2. Satpathy A T & Chang H Y. Long noncoding RNA in hematopoiesis and immunity. Immunity, 42(5), 792-804 (2015).

3. Luo, M. et al. Long non-coding RNAs control hematopoietic stem cell function. Cell stem cell, 16, 426-438 (2015).

4. Zhou, F. et al. Tracing haematopoietic stem cell formation at single-cell resolution.Nature, 533, 487-492 (2016).

5. Zhou, J. et al. H19 lncRNA alters DNA methylation genome wide by regulating S-adenosylhomocysteine hydrolase. Nature Communications, 6, 10221 (2015).

6. Venkatraman, A. et al. Maternal imprinting at the H19–Igf2 locus maintains adult haematopoietic stem cell quiescence. Nature, 500(7462), 345 (2013).

(此文为转载)返回搜狐,查看更多

责任编辑:

声明:该文观点仅代表作者本人,搜狐号系信息发布平台,搜狐仅提供信息存储空间服务。
阅读 ()
免费获取
今日搜狐热点
今日推荐