图2.种子细胞解离，单细胞率统计示例；通过细胞计数仪检测，示例样本中12%的细胞形成了含5个及以上细胞的团块

2.单细胞传代的主要优势

• 细胞计数准确性更高，工艺可追溯性更强；

• 初始形成的聚集体体积更小、数量更多；

• 工艺参数更易实现从小试到中试的放大平移；

• 收获得到的聚集体尺寸均一性更好。

以上特性共同保障了培养流程的稳定性，可提升细胞潜在扩增倍数，实现对聚集体形态与大小的准确控制。

二、iPSC接种前的标准化准备流程

在正式接种前，需完成培养基预平衡、质量检测与关键试剂添加三个步骤，为细胞提供稳定的初始培养环境。

1.培养基预平衡（提前12~24小时）

• 向反应器中加入占工作体积95%的不含ROCK抑制剂的完全培养基；

• 0.1L规格容器：加入95mL；0.5L规格容器：加入475mL；

• 将反应器置于培养箱中，设置目标搅拌转速（推荐40rpm）过夜平衡；

• 培养箱参数设置：37℃、5%CO₂、相对湿度≥90%。

图3.培养基预平衡示意图

2.培养基质量检测（接种前必做步骤）

转移3~5mL培养基至生物安全柜，检测以下关键参数并记录，作为工艺基线与后续过程控制的参照：

表1.新鲜iPSC扩增培养基的典型值

图4.接种前培养基质量检测与记录；可通过代谢分析仪、pH计等设备完成参数检测

3.ROCK抑制剂的准确添加

• 按终工作浓度10μM计算所需ROCK抑制剂（ROCKi）的体积；

• 将其与少量新鲜培养基混匀后无菌过滤；

• 加入反应器中，使培养基总体积恢复至95%工作体积。

图5.Rocki使用推荐操作流程

关键注意事项：ROCK抑制剂需在接种前30分钟内加入，过早加入会导致药效衰减，影响单细胞的存活状态。

三、标准化接种操作与参数控制

接种密度与接种方法直接决定后续聚集体的大小与生长状态，需遵循标准化的参数与操作规范。

1.接种密度的参考范围

在Mini级垂直轮反应器中，iPSC3D培养的推荐接种密度为2×10⁴活细胞/mL，可根据具体细胞株与工艺需求在2×10⁴~1×10⁵范围内优化：

• 接种密度过低：聚集体形成困难，细胞凋亡比例升高；

• 接种密度过高：聚集体体积过大，易出现中心坏死，分化效率下降。

2.浓缩接种液制备

• 接种密度：指每毫升培养体系中接入的活细胞数量；

• 接种物：用于接入培养体系的浓缩细胞悬液。

通常制备浓度为4×10⁵活细胞/mL的浓缩接种液，接种体积占总工作体积的5%：

• 0.1L反应罐：加入5mL接种液；

• 0.5L反应罐：加入25mL接种液。

可通过稀释公式C₁V₁=C₂V₂计算所需细胞量，建议多制备10%~20%的接种液，以补偿移液过程中的损失。

图6.接种液体积与体系体积比例示意图

3.标准化接种操作步骤

（1）将反应器转移至生物安全柜内；

（2）接种前充分混匀细胞悬液，每次吸取前均需重新混匀；

（3）使用血清移液管缓慢加入接种液，加入后冲洗移液管一次，减少细胞残留；

（4）立即将反应器放回培养箱，启动搅拌程序。

图7.接种操作示意图

操作避坑提示：禁止使用微量移液器转移接种液。微量移液器的小口会产生较高剪切力，可导致细胞活力下降15%~20%。

四、接种与混合的操作要点

垂直轮生物反应器具备低剪切、高均一的混合特性，通过规范的操作可充分发挥其工艺优势。

不同操作场景的工具选择

表2.不同场景的接种工具选择

图8.接种示意图

接种与混合的核心原则

1. 所有细胞悬液在转移前必须温和充分混匀，保证细胞分布均匀；

2. 同一批次实验的所有反应器需使用同一批接种液，减少系统误差；

3. 接种后2小时内取样计数，验证实际接种密度，修正工艺参数。

五、工艺要点总结

1. 3D培养传代优先采用单细胞悬液接种，不推荐团块传代，以保障聚集体均一性与工艺可放大性。

2. 接种前需将培养基加入反应器，在培养箱中完成充分的温度、pH与溶氧平衡。

3. 接种前检测新鲜培养基的pH、营养物质与代谢物浓度，用于工艺表征、过程控制与后续放大参照。

4. 同一批次实验制备统一的浓缩细胞接种液，保证各反应器接种条件一致；建议同步设置2D培养对照组。

5. 细胞悬液分装、转移前必须充分混匀，避免细胞沉降导致的密度不均。

注：本文由曼博生物整理自生物反应器公开技术资料，仅供科研实验参考。返回搜狐，查看更多