基于动态微流控系统重建血管内皮屏障与肿瘤微环境
本文摘要：实体瘤治疗过程中，CAR-T细胞穿过血管内皮是起效关键，常规静态共培养体系难以还原体内血流、血管屏障微环境。本文依托微流控器官系统搭建动态灌流黑色素瘤体外模型，利用Transwell双腔室构建人源内皮单层，系统观测内皮激活、趋化因子、流体条件如何改变CAR-T细胞浸润能力与裂解肿瘤的效果，为实体瘤免疫疗法体外测评提供贴合生理的实验方案。
关键词：器官芯片、黑色素瘤、CAR-T疗法、血管内皮屏障、免疫细胞迁移、体外药效评估、微流控、肿瘤微环境
一、传统共培养局限与器官芯片肿瘤模型应用价值
CAR-T细胞疗法在血液肿瘤中收获不错疗效，但应用于实体瘤仍存在诸多阻碍。免疫细胞需要穿过血管内皮、渗入肿瘤组织才能接触靶细胞，传统静态共培养体系无法复刻血液循环、血管屏障、趋化因子梯度等生理条件，对体内药效的预判效果有限。
癌症器官芯片系统依托微流控灌流复刻体液流动，通过多细胞共培养重建组织屏障与局部微环境，能够完整复现免疫细胞循环、跨内皮穿行、肿瘤浸润、癌细胞裂解整套生理反应。本内容来自2026年欧洲器官芯片年会发布的欧盟Melomanes项目成果，项目目标搭建动态灌流黑色素瘤体外模型，测评抗HLA-GCAR-T细胞的作用效果与安全特征。
图1.2026欧洲器官芯片年会
二、研究目标
1.采用SK-MEL-5人黑色素瘤细胞，在微流控器官芯片系统内构建稳定黑色素瘤体外模型；
2.搭建人脐静脉内皮细胞（HUVEC）单层结构，观测TNF-α刺激引发的内皮激活变化；
3.分析基底侧灌流操作对内皮单层完整度造成的影响；
4.观测趋化因子诱导下CAR-T细胞移动、跨内皮穿行能力，以及和内皮激活状态的关联；
5.对比不同流体条件、内皮状态下，CAR-T细胞裂解肿瘤细胞的能力。
三、模型构建与实验方法
3.1 芯片系统与细胞
整套实验依托PhysioMimix微流控器官芯片系统搭建，采用Transwell双腔结构分隔血管腔与肿瘤区域，依靠培养基循环复刻体内血流剪切力与物质交换过程。
- 内皮结构制备：将HUVEC接种在IV型胶原包被Transwell膜，以0.5μL/s流速持续灌流培养48h，形成连续内皮单层；
- 肿瘤细胞改造：慢病毒转染SK-MEL-5细胞，稳定持续表达HLA-G抗原，作为CAR-T作用靶标；
- 效应细胞：靶向HLA-GCAR-T细胞。
图2.黑色素瘤器官芯片模型的建立
3.2 检测评价手段
1.内皮单层完整度：F-actin、ZO-1免疫荧光染色观测细胞连接形态，结合跨内皮电阻（TEER）、4kDaFITC-葡聚糖渗透系数定量评估屏障阻隔能力；
2.内皮激活特征：免疫荧光检测VCAM黏附分子表达量，判断TNF-α刺激带来的细胞状态变化；
3.免疫细胞穿行实验：统计不同组别CAR-T细胞由上腔跨膜移动至基底侧的细胞占比；
4.细胞裂解测评：设置梯度效靶比（E:T），统计不同时长下肿瘤细胞死亡占比。
3.3 模型搭建时序
Transwell膜胶原包被→HUVEC接种灌流培养→内皮完整度检测→TNF-α刺激激活内皮→铺种黑色素瘤细胞→加入CAR-T细胞，开展迁移、杀伤两组检测。
图3.黑色素瘤芯片模型生成的时间进程
四、核心实验结果
4.1 TNF-α刺激可改变内皮屏障通透能力
经TNF-α处理后的内皮细胞出现激活特征：VCAM-1表达量有所提升，细胞间连接结构消失，细胞形态拉长分散，屏障通透能力上升，可复刻肿瘤周边炎症型血管的生理特征。
图4.Transwell膜基底侧内皮屏障的优化。
图4.Transwell膜基底侧内皮屏障的优化。a：左图为相差显微图像，右图为相差显微图像与Phalloidin-FITC荧光图像的叠加图，显示Transwell膜孔已被HUVEC覆盖。b：TNF-α处理后，Transwell上内皮细胞间黏附丧失（Phalloidin，绿色，1:400；ZO-1，红色，1:1000）。c：TNF-α刺激后，免疫荧光（IF）染色显示VCAM-1表达上调（左图，1:500）；同时，细胞形态表现为细胞体分离并呈细长状（右图，96孔板）。
4.2 灌流处理可提升内皮单层完整度
结合TEER与葡聚糖渗透两项检测数据能够看出：
1.IV型胶原包被Transwell膜，相比空白膜可提升内皮单层致密程度；
2.基底侧持续灌流培养的内皮结构，完整度高于静态静置培养，细胞接种方向同样会改变屏障阻隔效果；
3.内皮致密程度随培养时长发生动态改变，灌流48h后屏障结构趋于稳定。
图5.通过FITC-dextran测定表观渗透系数（Papp）并监测跨内皮电阻（TEER）评价内皮屏障完整性
图5.通过FITC-dextran测定表观渗透系数（Papp）并监测跨内皮电阻（TEER）评价内皮屏障完整性。a.人Ⅳ型胶原包被Transwell膜可提高内皮屏障完整性。b.基底侧灌流和细胞接种方向均会影响内皮屏障完整性。c.HUVEC内皮屏障完整性具有时间依赖性，随接种后的培养时间而发生动态变化。
4.3多重条件共同改变CAR-T跨内皮穿行效率
CAR-T细胞穿过内皮的比例，会随内皮状态、趋化因子、流体条件发生改变：无内皮阻隔时细胞穿行占比更高；完整内皮单层会减少细胞跨膜数量；加入CXCL10趋化因子，可带动CAR-T定向移动；TNF-α激活内皮后，细胞黏附特性改变，也会调整穿行比例；动态灌流组细胞移动规律和静态组别存在区别，更贴合体内循环环境。
图6.免疫细胞跨越Transwell膜的迁移受内皮屏障表型和趋化因子信号传导的影响。
图6.免疫细胞跨越Transwell膜的迁移受内皮屏障表型和趋化因子信号传导的影响。a.灌流和HUVEC的培养均会影响免疫细胞的迁移率及其滞留程度。b.细胞因子刺激、灌流以及缺乏趋化因子信号均导致免疫细胞的基础回收率更低。
4.4CAR-T裂解肿瘤细胞的能力受多重条件调控
CAR-T完成跨膜移动后依旧保有细胞毒作用，但裂解肿瘤的能力会因内皮阻隔、流体、效靶比出现变化：
1.效靶比值越高，肿瘤细胞死亡占比越高；
2.持续灌流环境下，偏低效靶比也能产生可观的肿瘤裂解效果；
3.内皮单层会形成物理阻隔，相比无屏障直接共培养，同等时长下肿瘤细胞死亡率有所下降，和实体瘤体内作用逻辑保持一致。
图6.抗HLA-GCAR-T细胞对SK-MEL-5细胞的杀伤效率受基底侧灌流和内皮屏障限制的效应细胞相互作用调控 编辑
图6.抗HLA-GCAR-T细胞对SK-MEL-5细胞的杀伤效率受基底侧灌流和内皮屏障限制的效应细胞相互作用调控。a.癌细胞死亡速率取决于效应细胞与靶细胞比例（E:T）。b.在24h时，灌流培养可使较低E:T比例下仍产生细胞毒作用。c.跨越血管内皮屏障的迁移会影响癌细胞死亡速率，其作用取决于细胞因子处理。
五、研究结论与意义
1.本次实验搭建的黑色素瘤微流控系统，搭配内皮细胞、肿瘤细胞、靶向CAR-T三类细胞，可在动态流体环境完整复现免疫细胞作用全流程。
2.优化胞外基质包被搭配持续灌流，能够让HUVEC内皮单层的致密程度得到提升，还原真实血管生理结构。
3.CAR-T细胞具备裂解黑色素瘤的能力，裂解水平和效靶比例、流体环境、靶细胞抗原表达量存在关联。
4.有无TNF-α激活的两种内皮单层，都会形成物理阻隔，对比无屏障共培养，肿瘤细胞裂解比例会出现回落，贴合实体瘤治疗体内限制条件。
5.这套微流控体外系统可作为贴合生理的临床前实验载体，用于实体瘤CAR-T细胞浸润、药效测评，也能辅助免疫治疗方案优化与安全测评，减少动物实验使用量。
参考来源：EUROoCS Annual Meeting 2026会议海报，Melomanes项目研究成果本文由曼博生物基于器官芯片相关文献资料整理，仅作科研技术信息分享，具体实验方案请结合研究需求优化验证。返回搜狐，查看更多