1944 年，美国细菌学家艾弗里（Avery） 通过肺炎双球菌转化实验证明了DNA 是遗传信息的载体[1]。 此后，人们一直致力于DNA 结构和序列研究，DNA测序技术应运而生。DNA是由腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）与鸟嘌呤的（G）四种核苷酸编码而成的双链序列（图一），DNA测序则是分析特定DNA片段的碱基序列，也就是A、T、C、G的排列方式。该技术对探索生命奥秘、治疗疾病，以及整个生物科学乃至医学的发展起到了巨大的推动作用，并具有广阔的应用前景。
图一 DNA是由A、T、C、G四种核苷酸编码而成的双链序列
回顾DNA测序技术的发展历程（图二），从最初的依赖于一些生物化学方法和电泳分离技术的手工测序，到1986年第一台自动化测序仪的产生（结合荧光标记和毛细管阵列电泳技术来实现DNA测序的自动化），再到大规模平行测序第二代测序平台的产生，以及近年来新兴的单分子长度长的第三代测序技术，测序技术已取得了相当大的进步[2]。它的发展使人们对生命遗传物质DNA的认识层次不断升华，从对单一、局部的基因或基因片段的研究转变成了对整个基因组的研究。
图二 DNA测序技术的产生与发展：DNA的发现和合成（蓝色），第一代测序技术的产生与发展（粉色），第二代测序技术（绿色）、第三代测序技术（橙色）。
第一代测序技术
20 世纪70年代中期，科学家们提出了2 种不同的DNA测序方法：1）Sanger 等[3]提出“DNA双脱氧链末端终止测序”，又称Sanger 测序；2）Maxam 等[4]提出“DNA化学降解测序”。DNA链终止法、化学降解法，以及在它们的基础上发展来的自动测序技术被称为第一代DNA测序技术[2]。
Sanger的DNA双脱氧链末端终止测序法的基本步骤是：在4只试管中加入待测序列（即DNA模板），适当的引物，DNA聚合酶，和4种单脱氧核苷三磷酸(dNTP，分为dATP，dCTP，dGTP和dTTP)，再在上述4只试管中分别加入一种一定浓度的带有放射性同位素如32P标记的双脱氧核苷三磷酸ddNTP（分为ddATP,ddCTP,ddGTP和ddTTP），混合后反应（图三A）。DNA 聚合酶不能区分 dNTP 和 ddNTP，因此 ddNTP可以掺入新生单链中。若新生单链掺入的是双脱氧核苷三磷酸（ddNTP），由于ddNTP的核糖基3’碳原子上连接的是氢原子而不是羟基[3]，不能形成磷酸二酯键，所以不能与下一个核苷酸聚合延伸，合成的新生单链在此终止，终止点由反应中相应的双脱氧核苷酸三磷酸而定。若新生单链掺入的是单脱氧核苷三磷酸（dNTP），链就可以继续延长。如此每管反应体系中便合成以各自的双脱氧碱基为3’端的一系列长度不等的核酸片段（图三B）。反应终止后，将反应产物分4个泳道进行变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离长短不一的DNA片段，长度相邻的片段相差一个碱基（图三C）。经过放射自显影后，根据片段3’端的双脱氧核苷酸，便可依次阅读合成片段的碱基排列顺序（图三D）。DNA化学降解测序的测序原理[4]是在选定的核苷酸碱基中引入化学基团，经过化合物处理使DNA 分子在被修饰的核苷酸位置降解。其基本思想也是根据核苷酸在某一固定的点起始，随机在某一特定碱基处终止，形成一系列以某一特定脱氧核糖核苷酸（A、T、C、G）为末端的长度各异的寡聚脱氧核糖核苷酸混合物，然后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，经放射自显影后，直接从胶片上读出DNA的顺序。
上述两种测序方法都要依赖放射性同位素标记（32P，35S）来实现，操作步骤比较繁琐，且难以自动化，不能满足大规模测序的要求。于是，科学家们开始寻求新的非放射性标记的测序技术来克服这些缺点。20世纪 80年代末，科学家们开始用荧光标记的测序技术取代同位素标记测序，四色荧光标记的应用使测序反应物的分离能在一个变性聚丙烯酰胺凝胶电泳的泳道完成，从而降低了泳道间迁移率的差异对测序精度的影响，为一块平板胶做96个样品的高密度电泳的发展奠定了基础[5]。为了获得更高通量，20世纪90年代，科学家们用毛细管列阵电泳取代聚丙烯凝胶平板电泳[6]，使样本分离可在一系列平行的石英毛细管内进行，可同时并行分析多个样本[7]，进一步加快了DNA的测序速度，如这一时期ABI 公司开发的ABI 3730测序仪。
图三 Sanger的DNA双脱氧链末端终止测序法
第二代测序技术
因为要依赖电泳分离技术，第一代测序技术的分析速度和并行化程度较难提升，测序成本也很难降低。然而，随着2001年人类基因组计划的完成，人们进入了后基因组时代，即功能基因组时代，深度测序和重复测序等大规模基因组测序需求越来越多。第一代测序方法已经不能满足这些需求，科学家们开始寻求新的测序方法。于是，第二代测序技术，即大规模平行测序技术应运而生。大规模平行测序平台的出现不仅令DNA测序费用降到了以前的百分之一，并且由于其高通量的特征，一次能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测序，使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。让基因组测序这项以前专属于大型测序中心的“特权”能够被众多研究人员分享。市面上出现了很多第二代测序仪产品，例如美国Roche Applied Science公司的454基因组测序仪、美国Illumina公司和英国Solexa technology公司合作开发的Illumina测序仪、美国Applied Biosystems公司的SOLiD测序仪。
第二代测序技术核心思想是边合成边测序，即通过捕捉新合成的末端的标记来确定DNA的序列。例如Illumina/Solexa Genome Analyzer测序技术[7]，其技术原理和流程如图四所示：（1）构建短链片段DNA库：利用超声波把待测的DNA样本打断成小片段（图四B），主要是打断成200-500bp长的片段，并在这些小片段的两端添加上不同的接头引物（图四C），构建出单链DNA文库。（2）DNA片段吸附：当DNA文库建好后，用NaOH将双链DNA变性形成单链（图四D），随后便进入测序芯片（图四E）。每个测序芯片有8个槽道，每个槽道的上下表面都附有很多接头（图四F），这些接头能和建库过程中加在DNA片段两端的接头相互配对。因此，带有接头的文库单链DNA在通过测序芯片槽道的时候会随机附着在槽道上（图四G）。并能支持DNA在其表面进行后续的聚合酶链式反应[8] (polymerase chain reaction，PCR)扩增。（3）DNA扩增: DNA扩增以槽道表面所固定的接头为模板，进行PCR扩增。经过不断的扩增和变性循环，最终每个DNA片段都将在各自的位置上集成一束（图四H），每一个束都含有单个DNA模板的很多分拷贝，进行这一过程的目的在于实现将碱基的信号强度放大，以达到测序所需的信号要求。（4）荧光测序（图四I）：荧光测序是在前面的DNA扩增过程中同步进行的。向DNA扩增的反应体系中添加DNA聚合酶、特定一端的接头引物和带有不同荧光标记的4种dNTP，这些dNTP的3’-OH被化学方法所保护，因而每次只能添加一个dNTP，DNA链复制反应就会停止。在dNTP被添加到合成链上后，所有未使用的游离dNTP和DNA聚合酶会被洗脱掉。接着，再加入激发荧光所需的缓冲液，用以激光激发荧光信号，搜集信号记录在计算机中并找出对应碱基。在荧光信号记录完成后，再加入化学试剂淬灭荧光信号并去除dNTP 3’-OH保护基团，以便能进行下一轮的测序反应，如此循环至序列结束。
图四 第二代测序Illumina测序流程
第三代测序技术
如果说第一代测序技术的特点是“线性的”，仪器每次运行只能读取有限的几条“通道”上的数据，那么第二代克隆扩增型测序则是“平面的”，仪器每运行一次可以读取整个平面上成千上万个测定点的数据，即它具有高度的并行性、高通量、操作简单、成本低等优势。但克隆扩增型测序也存在致命的缺陷，即序列读长很短，这就给后期的基因组序列组装带来了巨大的压力。
为了克服第二代测序中克隆扩增型读长短的问题，以单分子、长读长测序为目标的第三代测序技术应运而生。第三代测序技术也是一种边合成边测序的测序技术，然而不同于第二代测序依赖于DNA模板与固体表面相结合然后边合成边测序，第三代分子测序不需要进行聚合酶链式反应 (polymerase chain reaction，PCR)扩增，能够直接观察和测定DNA分子的数量和序列的结构。代表性的第三代测序平台，主要有Pacific Bioscience公司的单分子实时测序技术（即SMRT技术）、Helico BioScience 公司单分子测序技术、Oxford Nanopore Technologies公司的纳米孔单分子测序技术，以及基于高密度半导体芯片的Ion Torrent技术。
目前，应用比较多的是Pacific Bioscience的SMRT技术。SMRT主要采用四色荧光标记的dNTP和单分子实时芯片上的零级波导 （zero-mode waveguides，ZMW）对单个DNA分子进行测序[9]（如图五A）。ZWM是一种直径 50~100 nm、深度100 nm的孔状纳米光电结构，当光线进入后呈指数衰减，仅靠近基底的部分被照亮。DNA聚合酶固定在ZMW底部，加入DNA模版、引物和四色荧光标记的dNTP后进行DNA合成。被荧光标记磷酸基团的核苷酸在ZMW底部的DNA聚合酶活性位点上与模板链结合（如图五B1，带黄色荧光标记的胞嘧啶脱氧核苷酸（C）与DNA模板结合），被激发出荧光（如图五B2，胞嘧啶脱氧核苷酸（C）的磷酸基团被激发出黄光），在荧光脉冲结束后，被标记的磷酸基团被切割并释放（如图五B3，黄色的磷酸基团被切割），聚合酶转移到下一个位置（如图五B4），下一个脱氧核苷酸连接到位点上开始释放荧光脉冲（如图五B5，带有蓝色荧光标记磷酸基团的腺嘌呤脱氧核苷酸（A）将被连接）。如此循环，直到模板序列结束。机器根据不同碱基的发出的不同荧光实时判断加入DNA模板上的碱基类型，从而解读模板序列。
图五 Pacific Bioscience的SMRT测序技术原理
DNA测序技术发展至今已有三十多年时间，从手工测序到第一代再到第三代，测序技术经历了巨大的发展（图一）。测序技术的每一次变革，对基因组研究，疾病医疗研究，药物研发，育种等领域产生了巨大的推动作用。其中测序成本，读长和通量是评估一项测序技术先进与否的三个重要指标。第一代和第二代测序技术除了通量和成本上的差异之外，其测序核心原理（除Solid是边连接边测序之外）都是基于边合成边测序的思想。第二代测序技术的优点是成本较之一代大大下降，通量大大提升，但缺点是所引入聚合酶链式反应过程会在一定程度上增加测序的错误率，并且具有系统偏向性，同时读长也比较短（表一）。第三代测序技术是为了解决第二代所存在的缺点而开发的，它的根本特点是单分子合成测序，不需要任何聚合酶链式反应的过程，这是为了能有效避免因聚合酶链式反应偏向性而导致的系统错误，同时提高读长，并保持高通量，低成本的优点。但是目前，三代测序在准确度上较二代差。未来，相信随着现代光学、纳米技术、计算机科学等多学科的全面发展，人们将克服困难，利用更加先进的显微镜技术、纳米孔或石墨烯来直接读取DNA序列，测序速度和精度将得到更大的提升。相信随着测序技术的不断完善，生命科学将进入一个空前繁荣的新时期，极大地推动人类文明的进程。
参考文献:
1. Avery OT, Macleod CM, McCarty M: Studies on the Chemical Nature of the Substance Inducing Transformation of Pneumococcal Types : Induction of Transformation by a Desoxyribonucleic Acid Fraction Isolated from Pneumococcus Type Iii.J Exp Med1944, 79:137-158.
2. Buermans HP, den Dunnen JT: Next generation sequencing technology: Advances and applications. Biochim Biophys Acta2014, 1842:1932-1941.
3. Sanger F, Nicklen S, Coulson AR: DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA1977, 74:5463-5467.
4. Maxam AM, Gilbert W: A new method for sequencing DNA. Proc Natl Acad Sci USA1977, 74:560-564.
5. 甄志成: 毛细管阵列电泳与规模化 DNA 测序. 色谱 2001, 19:361-364.
6. Ruiz-Martinez MC, Berka J, Belenkii A, Foret F, Miller AW, Karger BL: DNA sequencing by capillary electrophoresis with replaceable linear polyacrylamide and laser-induced fluorescence detection. ANALYTICAL CHEMISTRY-WASHINGTON DC- 1993, 65:2851-2851.
7. Hunkapiller T, Kaiser RJ, Koop BF, Hood L: Large-scale and automated DNA sequence determination. Science1991, 254:59-67.
8. 张秀军: 聚合酶链式反应. 唐山师范学院学报 2001, 2:030.
9. Eid J, Fehr A, Gray J, Luong K, Lyle J, Otto G, Peluso P, Rank D, Baybayan P, Bettman B: Real-time DNA sequencing from single polymerase molecules.Science2009, 323:133-138.
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