Q:为什么提取RNA比提取DNA更为麻烦一点,RNA就像一个捣蛋鬼,经常降解呢?
A:大家都知道因为核酸作为一种高分子化合物,几乎参与所有细胞的生化过程。其中单链结构的RNA比双链的DNA更容易降解,同时戊糖2位上的羟基导致RNA更加不稳定。然后,无论是内源性的RNA酶还是外源性的RNA酶都非常多,且活性强。因此在RNA提取中,RNA容易讲解。

Q:要怎么做才能简便稳定的得到比较好的RNA呢?
A:在RNA提取中主要有三个原则,如果做到的话,就能简便稳定得到我们想要的RNA了:
(1)保证核酸的一级结构的完整性
(2)去除其他杂质的污染,获得高纯度RNA
(3)操作简便,稳定性强

Q:RNA的提取原理是什么呢?
A:RNA的提取原理说起来很简单:就是将细胞裂解,释放出RNA,并通过不同方式去除蛋白,DNA等杂质,最终获得高纯度RNA产物的过程。
Q:我们主要是怎么提取RNA的呢?
A:我们实验室的RNA提取方法大多以试剂盒为主,比如Norgen、Qiagen都是很好用的,与传统的TRIZOL沉淀法相比最主要的就是多了一个用于纯化的柱子。
以硅基质吸附法为例:采用硅基质吸附达到RNA分离纯化的原理,主要是利用核酸与硅基质材料在高盐条件下结合,在低盐条件下脱离的特征,其机理为高浓度盐离子破坏硅基质水分子结构,形成阳离子桥,核酸便容易与硅基质结合;而当盐被清洗后,硅石又可以重新水化,再水化的硅石便会破坏基质和核酸之间的吸引力,最后用RNase-Free去离子水将RNA从硅膜上洗脱下来。而蛋白、有机溶剂等杂质在高盐条件下不能结合到膜上而被首先洗脱下来,因此用这种方法可以非常方便的得到高纯度的RNA。
当然,不同的试剂盒有不同的介质吸附RNA,如硅基质,磁珠,树脂等等。
Q:试剂盒的原理和优劣势有哪些呢?
A:试剂盒提取RNA的原理主要是:利用硅胶膜特异性吸附原理实现核酸分离,即根据缓冲液体系的盐离子浓度和PH值与柱子上的Si基质(树脂)结合RNA的方式绑定RNA,主要优点有重复性好,回收率高且操作简便。
相较于重沉淀的优势是:柱纯化效果好,速度快;劣势就是在试剂盒纯化过程中会有部分RNA损耗
Q:那听说你们要开始改用半自动的方法来提高RNA提取的准确度了,你们是如何做的呢?
A:emmm,预知后事如何且听下回分解
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