万字长文教你做m6A-IP-qPCR至尊豪华版 | m6A专题

那么既要验证多个基因，RNA起始量确实不足（临床样本或稀有样本），这个时候有一个非常tricky的做法那就是对原本起始量较低的RNA模板进行多轮扩增，这时候你的cDNA量变多了，意味着你能间接多验证几个基因。只是这种做法较为讨巧，不遇到特殊情况还是不推荐使用。

另一个老生常谈的问题就是，如果不马上进行验证，我的RNA能保存多久，到底要不要富集mRNA，到底是直接用RNA好还是反转录成cDNA好，我的引物设计对象也需要一起跟着反转录吗？

这些答案也不复杂，total RNA提取完毕后放入NF水，在-80℃环境下保存时间至少在2-4周。如果对total RNA进行了mRNA富集，请立即在2天内开展实验，否则mRNA会发生严重降解。至于cDNA如果有长途运输情况存在，不建议寄送RNA，还是寄送cDNA为主。这时候可以把Input和IP下来的产物反转录，放入NF水中干冰运输。所以针对cDNA的引物在设计上需要跟着一起互补！

那么很多m 6A文章，不管是测序还是IP-PCR，似乎都没做IgG实验，这是很多同学的疑惑，那么这边也跟大家说下，理论上IgG实验必须要做，但是m 6A修饰属于碱基修饰，而IgG只能结合蛋白，通常情况下IgG似乎不太可能直接IP到RNA。根据联川生物几年内测和生产经验来看，IgG几乎IP不到任何RNA。

在厘清这些很容易产生干扰的问题后，下面我们进入正题。

根据上面的推算，IP下来的mRNA若有500ng，可以验证6-12个基因左右（1个基因3个生物学重复，每个重复3个复孔即技术重复，所以一个基因总计9次反应）。哺乳动物IP效率在10-20%左右，植物在20-40%左右（最高可达50%）。那么假设要验证6-10个基因，哺乳动物需要至少2.5-5μg的mRNA和100-200μg的total RNA，植物样本至少需要1.25-2.5μg的mRNA和50-100μg的total RNA。若加入IgG抗体这个步骤，则需要对total RNA的起始量再次翻倍。

但是如果total RNA太少该怎么处理呢？这就又回到了最开始的问题，那就是直接用m 6A抗体对total RNA进行IP，而且不用打断。

那么接下来在进行讲解前的第二个问题就是，明明我们做高通量测序只有一个Input文库和一个IP文库，而且前文也讲到了现在几乎可以不做IgG，为何我们做m 6A-IP-qPCR 要加入IgG抗体呢（如下图所示）？早期的m 6A论文数量较少，我们会尽量从原理层面帮大家梳理下。

高通量测序可以对所有被m 6A抗体富集下来的RNA进行全转录层面的扫描分析，一旦m 6A抗体有非特异性富集，在数据呈现上我们可以明显发现reads的分布比较乱且没有规律，而特异性富集则reads几乎富集在哺乳动物的3’UTR区和植物的5’UTR和3’UTR区。所以这就是测序不需要IgG文库，而我们做m 6A-IP-qPCR 需要IgG富集的原因。但是由于大量研究和无数生化实验已经证实IgG几乎不会IP到RNA，所以IgG这一步目前可以省略。即便是做了大量结果也是0，在后期归一化期间这部分数据不算在内。

搞定了样本起始量和IgG的问题后，我们具体来看下步骤：

• 第一步，先对RNA进行特异性富集。至于打断或不打断，都是可行的。假如要打断的话请在打断之前，确认研究对象只是mRNA还是lncRNA。若只研究mRNA 可以先用oligodT磁珠进行富集后再进行打断。如果是lncRNA和mRNA都要研究，则需要先用试剂盒将total RNA的rRNA先消化干净，再进行打断。如果是进行高通量测序打断长度约为100nt左右，而qPCR 则需要长度至少在200nt以上，部分论文甚至打断长度在300-500nt左右甚至都不打断。一般根据文献中的资料显示，IP下来的片段用引物扩增出来的长度在130-150左右，所以100nt不到的长度要设计出合适的引物会非常困难。除非是用5’RACE扩增，否则还是建议大于200nt。当然了，如果不打断的话设计引物就会比较方便。当然如果total RNA本身量比较少，建议老师直接用m 6 A抗体对total RNA进行富集。
• 第二步，对RNA进行抗体孵育和特异性富集。打断完了RNA我们会得到长度约为200-300的RNA片段。如果是不打断则是较为完整的RNA全长。这时候我们可以分出约占m 6 A-IP部分RNA只有10%的RNA作为input。当然如果是细胞样本比较充足，Input和IP的比例可以直接是1:1。如果按照1:1:1，简单来说用于m 6 A IP的RNA有,3μg，那么Input、IP和IgG的RNA都在1μg左右（无论是total RNA还是mRNA）。如果不含IgG，2μg total RNA直接按照1:1比例分配IP和Input样本。

• 第三步，洗脱和逆转录扩增。接下来我们需要对m 6 A抗体和IgG抗体上洗脱下来的RNA，以及Input的RNA，按照常规试剂盒要求进行洗脱，并用随机引物进行逆转录。这边如果RNA起始量较低，洗脱体积（elution buffer）可以适当增加25~30%，洗脱次数可以从2次增加到4-6次。
• 第四步，设计m 6 A-IP-qPCR 的特异性引物。由于m 6 A甲基化基本富集在UTR区和转录终止区，所以如上图所示在这些区域附近我们可以从测序结果里有明显的peak峰。那么我们设计引物可以考虑在基因高甲基化区域来进行。如果某几个常见的基因在不同文献里频繁出现，那么文献里列出来的引物可以被我们直接拿来引用。通常最后PCR产物长度最低会在130-150bp左右。这里需要注意的是，IP下来的RNA需要用随机引物进行逆转录，而第四步中设计的引物用的是特异性引物，这个大家要注意区分和甄别。另外如果对RNA不富集不打断，在引物设计上按照常规PCR引物设计即可。

• 第五步，使用上一步设计好的引物，对Input、m 6 A-IP和IgG-IP（IgG部分通常数字为0）中的RNA进行qPCR反应并计算相应的CT值。

所以到这里我们的实验部分已经完成了，简单总结下就是想要做够10个左右基因的验证，必须至少提供>200μg的total RNA以上。富集的RNA类型根据自己要求出发，如polyA RNA或rRNA-depleted RNA等，最后就是打断成200-300nt左右的长度。用于qPCR的RNA一共分成3类，即Input、m 6A-IP和IgG-IP，其中input占m 6A-IP起始量约10%。如果用数字来表示那就是input需要100ng，m 6A在IP前需要1μg，IgG在IP前也需要1μg。如果IP:Input:IgG=1:1:1，则不需要做特别复杂的换算。目前部分课题组就像前面提到的会舍弃IgG，只有IP和Input，分别为1:1。所以按照total RNA不打断直接进行IP然后进行m 6A-IP-qPCR，由于m 6A修饰本身存在大小那么4-5μg total RNA，最后估算大致可以验证1-2个基因。

所以接下来我们就要详细讨论下m 6A-IP-qPCR 是如何计算相对表达量的。MeRIP-qPCR 是m 6A-IP-qPCR 的另一种说法。所以从名称上我们就能发现，m 6A-IP-qPCR基本和常规的RIP-qPCR相似。当然在讨论RIP-qPCR之前，我们先来看看常规的RT-qPCR 是如何计算相对表达量的。

关于RT-qPCR的方法学论文很多，所以这里关于实验部分就不细讲了。计算基因的绝对定量需要加入外参基因，所以暂且我们先来看看相对表达量，也就是RT-qPCR传统的2-ΔΔCt法是如何计算的。

假设验证一个基因，那么3个生物学重复（biological replication）是必须的，每个生物学重复要做3个复孔，我们也称之为技术重复（technical replication）。那么一个基因总共要做9个反应。

每1个样本的1个基因做3个复孔，内参基因和目的基因的Ct值分别取均值，最后得到Ct 内参和Ct 目的。如哺乳动物会选择GAPDH作为内参基因。其公式为：

处理组和对照组的所有样本都要这样计算。例如，处理组和对照组分别有3个和3个样本（即3个生物学重复），你会分别得到处理组的3个ΔCt和对照组的3个ΔCt。

然后用t检验检验下3个处理组样本的ΔCt和3个对照组样本ΔCt之间是否有统计学差异。将处理组的3个ΔCt取均值得到 ΔC处理组，将对照组的3个ΔCt取均值得到 ΔCt对照组。最后来计算ΔΔCt和相对表达量（即2的-ΔΔCt次方），公式分别为：

也就是处理组中某基因的表达量是对照组中表达量的 2-ΔΔCt倍。我们假设 ΔCt处理组和 ΔCt对照组分别是7和10，那么ΔΔCt=-3，最后相对表达量为8（2的3次方）。

我们从传统的RT-qPCR会发现，每个样本都要做一个内参基因，如上面提到的哺乳动物会选择GAPDH，而miRNA则会选择U6。那么我们的m 6A-IP-qPCR 是不是也需要内参基因，根据我们查阅的大量文献来看，绝大部分是没有的，少量文献也会使用到内参基因或者我们称之为negative control gene。

那么是不是m 6A-IP-qPCR 就真的没内参了呢？其实也不是！实际上我们会发现整个input充当了内参基因的概念，一个基因的甲基化水平是无法直接用RIP下来的RNA在做qPCR后直接用Ct值高低来衡量的，需要input中的RNA作为背景。而IgG抗体的加入则是为了排除m 6A抗体非特异性结合情况发生。由于有时候m 6A抗体不同厂家、保质期、蛋白性能等因素可能会产生非特异性结合的结果，这时候就需要用IgG来排除这部分的干扰。目前市面上使用的绝大部分m 6A抗体为兔抗，那么尽量在使用IgG做对照时也使用兔抗来源的IgG。

那么我们首先依旧是与传统的RT-qPCR相似，用相应的软件实时监测扩增曲线。溶解曲线必须是单峰，以保证引物特异性扩增。然后就是校准每一个样本的平均Ct值，以消除样本准备过程中的差异。

接下来我们就要开始对每个样本中，RIP和input的3个技术重复得到的Ct值计算平均值，再对3个生物学重复样本中的Ct平均值再去计算其Ct平均值，得到Average Ct RIP 和Average Ct input。最后计算稀释系数，即input dilution factor，也就是input的RNA占m 6A-IP的RNA有多少比例。根据上面的示例，也就是input RNA=100ng而m 6A-IP RNA=1μg，那此处的稀释系数=10%。最后根据这些数值，我们可以计算出归一化后的ΔCt值，也叫ΔCt normalized RIP。

这里为什么归一化后的ΔCt normalized RIPRIP还要减去log 2（input dilution factor）呢？那是因为需要减去input的噪音，排除其干扰。由于RNA样本特别稀少，所以在做实验的时候往往会把input的使用量按照一定比例减少。如本文中input的占比就只有10%，那么稀释倍数（Input Dilution Factor）就是0.1。最极端的情况，就是RNA十分的富余，所以当input的比例理论上和m 6A-IP及IgG-IP的比例一样时，那么log 2（input dilution factor）=0，也就无需相减了。所以加入稀释系数的校正，目的就是为了达到input:m 6A-IP:IgG-IP=1:1:1的效果。同样如果前期IP和Input比例为1:1，则不需要考虑这些复杂的换算了。

下一步就是要计算在RIP下来的RNA中某一个基因占input中这个基因有多少的百分比。换句话说就是有input中的某个基因究竟有百分之多少发生了甲基化，所以这里我们用% input来表示。基本上到这一步，部分老师不想做IgG验证的，会把这个数据直接放在论文里，但是我们建议还是要加入IgG的部分。当然这一步需要进行线性归一化处理，方法与上面的RT-qPCR 类似，其公式为：

由于无法判断m 6A抗体是否存在非特异性富集的情况，所以要过滤这些噪音还需要使用兔抗IgG再对RNA进行一次富集。这时候就需要对ΔCt再次进行背景去除。其中需要检测的目的基因在IgG中的ΔCt值就是ΔCt negative control 。其公式为：

最后一步就是最激动人心的一刻，那就是计算甲基化富集倍数，也叫Fold Enrichment，其公式为：

那么不加IgG可以直接将结果用于论文中的数据呈现吗？其实在部分的高分文章中我们也发现不用IgG直接进行验证的，即用%input数据直接用于表示甲基化比例。

终于到了喜闻乐见的暴力m 6A-IP-qPCR大法了！！

所以看完上面的这些复杂的文字后大家头晕了，那么还有没有更暴力更简单的方法呢？答案是肯定的！但是前提条件就是Input和IP比例保持一致即1:1，且前期直接对total RNA进行富集（不需要额外富集一次mRNA或lncRNA），使用以下简便的计算公式：

最后我们再来总结下两种不同的打断方法和各自的优劣势——

① 富集mRNA+打断

方法：提取total RNA→富集polyA mRNA→打断300-500nt长度→Input和IP前的RNA按照1:1等分的2份→m 6A-IP→返还IP后的RNA和Input RNA→（可选）反转录cDNA。

优劣：对于设计引物要求较高，只能设计在高m 6A甲基区域，打断长度不能太短，最好>300nt，每次PCR反应一个复孔5-10ng即可，起始量不足cDNA多P几轮，设计引物注意针对的是RNA还是cDNA，需要互补。

举例：提取total RNA 50μg→富集mRNA 600ng→打断300nt左右长度→剩余mRNA（300nt左右长度）400ng→按照1:1比例平等分Input为200ng，IP前样本200ng→m 6A-IP后得到RNA 15ng→得到Input产物200ng和IP产物15ng→反转录cDNA后得到最终的Input样本和IP样本

② total RNA不打断直接富集

方法：提取total RNA→按照1:1等分成2份→一份直接为Input，一份进行m 6A-IP→返还Input和IP后的RNA→（可选）反转录cDNA。

优劣：实验过程简单粗暴，引物设计无需考虑高m 6A甲基化区域，常规基因验证的PCR引物即可。适合新手和小白。由于携带有大量核糖体RNA，每个PCR反应的复孔需要至少100ng起，如果起始量不足，cDNA可以多P几轮，引物设计的话也要注意扩增的是RNA还是cDNA，需要互补。

举例：提取total RNA 30μg→取6μg total RNA→按照1:1等分，Input为3μg total RNA，IP前也为3μg total RNA→进行m 6A-IP,得到IP的RNA 200ng→得到最终的Input RNA产物3μg，IP RNA产物200ng→反转录cDNA后得到最终的Input样本和IP样本

注意事项：

3. IP下来的产物可使用体积比为25:24:1的酚:氯仿:异戊醇抽提RNA，也可直接加入Trizol试剂进行提取；
4. 实验过程中注意在RNase free的实验台上操作；
5. Total RNA 5-6μg如果不打断直接IP，理论上返还的Input和IP的RNA或cDNA只够验证1个基因。要验证多个基因一种方法是加大total RNA进入IP起始量，否则另一种取巧的办法就是cDNA多PCR几轮增加起始量；
6. 用于测序的IP产物还有大量剩余可以返还，这个说法是存在很大争议的。用于测序的IP产物，打断长度很碎，在100-200nt左右，这类RNA或cDNA无法设计PCR引物。另外通常50μg total RNA，富集一轮mRNA（<600ng）后进行片段化处理，然后才能进行IP，最后IP产物剩余量不足50ng。这个起始量对于测序的建库实验人员而言已经属于风险建库，已经无剩余IP产物返还。如果为了后期结果的准确性，建议重新准备样本或者单独分离一份样本进行额外的IP以用于PCR验证。

参考文献：

1. Castellanosrubio, A, et al. (2019) A novel RT-qPCR-based assay for the relative quantification of residue specific m 6 A RNA methylation. Scientific Reports 9.1
2. Weng, HY., et al. (2017) METTL14 Inhibits Hematopoietic Stem/Progenitor Differentiation and Promotes Leukemogenesis via mRNA m 6 A Modification. Cell Stem Cell 22.2
3. Ma, CH., et al. (2018) RNA m 6 A methylation participates in regulation of postnatal development of the mouse cerebellum. Genome Biology 19.1: 68.
4. Liu, J., et al. (2018) m 6 A mRNA methylation regulates AKT activity to promote the proliferation and tumorigenicity of endometrial cancer. Nature Cell Biology 20: 1074
5. Weng, YL., et al. (2018) Epitranomic m 6 A Regulation of Axon Regeneration in the Adult Mammalian Nervous System. Neuron 97.2: 313.
6. Gagliardi, M., et al. (2016) RIP: RNA Immunoprecipitation. Methods in Molecular Biology 1480: 73.
7. Dominissini, D, et al. (2013) Tranome-wide mapping of N6-methyladenosine by m 6 A-seq based on immunocapturing and massively parallel sequencing. Nature Protocols 8.1: 176-189.

辅助材料——m 6A-IP-qPCR不打断直接对total RNA进行IP富集的实验步骤

a.实验前期准备

在进行实验之前，在前期请仔细核对以下信息。在确保任何试剂耗材和仪器设备没有问题情况下，再开展后续实验。

• 仪器设备

冷冻离心机、磁力架、PCR仪、水浴锅、震荡金属浴、超净工作台和垂直混匀仪等

• 试剂盒与抗体

RNA提取试剂盒：任意组织对应的Total RNA提取试剂盒

免疫磁珠：货号为14311D Invitrogen Dynabeads Antibody Coupling Kit

RNase 酶抑制剂：Invitrogen 或NEB等品牌的RNase Inhibitor (10 U/μL)

• 试剂配制

m 6A binding buffer(10mL): 0.5 mL Tris-HCl (PH7.4, 1M), 1.5 mL NaCl (5 M), 0.5 mL NP-40 (10% vol/vol stock), 10μL Inhibitor,补ddH 2O至10mL

Elution buffer（50mL）:10mL 0.1M DTT, 0.44g NaCl, 2.5mL PH7.5 1M Tris-HCl, 0.1mL 0.5M EDTA,0.5mL 10%SDS, 10μL Inhibitor,补ddH 2O至50mL

b. 实验步骤

• 第一步，RNA提取：

可采用TriZol或者RNA提取试剂盒，按照说明进行操作即可，提取后待用。此外，需要将RNA一分为二，推荐按照1:1的比例，一部分用来做IP，另一份当作Input成为本底对照。

• 第二步，免疫磁珠与m 6 A抗体预混：

在本次实验中，我们是用有m 6A抗体结合的免疫磁珠来达到对m 6A修饰RNA的富集的，因此我们需要先制备磁珠，具体步骤如下。

取出Invitrogen Dynabeads Antibody Coupling Kit，在室温平衡半个小时后进行下述操作（（注：该步骤中的HB，LB和SB均来自于试剂盒，老师们可以直接用）：

（1）按照一个IP体系1 mg beads，5 μL抗体，45 μL C1，50μL C2的比例将上述试剂加入1.5 mL EP管内，吹打混匀（如若打算进行多次qPCR，建议按比例扩大上述体系，以免最终富集到的RNA量不够）；

（2）用封口膜包裹EP管，置于恒温震荡金属浴，37℃最大转速孵育16-24h。

（3）将EP管放置在磁力架上至少1min，待溶液澄清后，吸弃上清。

（4）加入800μL HB，吹打混匀，将EP管放置在磁力架上至少1min，待溶液澄清后，吸弃上清。

（5）加入800μL LB，吹打混匀，重复上述操作。

（6）加入800μL SB，吹打混匀，重复上述操作。

（7）重复步骤（4）一次（根据Antibody用量酌情增加重复次数）。

（8）加入800μL SB，吹打混匀，置于垂直混匀仪上混匀15min。

（9）将EP管放置在磁力架上至少1min，待溶液澄清后，吸弃上清。

（10）加入适量体积SB（150μL*样本数），吹打混匀，若不立即使用，置于4℃冰箱待用（不要超过48h）。

• 第三步，m 6 A-免疫磁珠与RNA相结合：

（1） 添加150μL已经在3.4步中预混好的m 6A-免疫磁珠，加入2 μg RNA（如打算获得更多沉淀下来的m 6A修饰RNA，可按照比例扩大免疫磁珠、RNA、binding buffer以及ddH2O的量），添加100 μL m 6A binding buffer并加ddH2O补足至500μL。

（2）将这些fragmented RNA与m 6A-免疫磁珠在室温下结合1小时，至于垂直混匀仪7圈/分钟。

（3）将EP管放置在磁力架上至少5min，待溶液澄清。

（4）弃上清。

• 第四步，m 6 A RNA洗脱（将免疫磁珠上的RNA片段洗脱下来）：

（1）将第三步中的EP管从磁力架上取下，加入预热的125μL Elution buffer，缓慢吹打混匀，在42℃下孵育5分钟。

（2）5分钟后再次进行一次缓慢吹打，将EP管置于磁力架上3min。

（3）吸取上清至新的1.5mL EP管。

（4）重复第（1）-（3）步骤三次，目的是将磁珠上RNA片段完全洗脱。

（5）将前面每次洗脱下来的Elution buffer混合到一起，EP管置于冰上。通过4轮洗脱，最后的EP管中的溶液体500μL。

• 第五步，RNA纯化：

经过洗脱的RNA可能存在浓度较低或者杂质较多的情况，因此需要进一步浓缩，在这里老师可以采用Qiagen货号为74204的RNeasy MinElute Cleanup Kit，提高样品的质量和浓度，使得下游PCR的过程更加的顺利。

Tips：富集前的总RNA总量可能和富集完成纯化后的RNA量有较大的数量级差别，这是正常的。原因在于：

1. 并非所有RNA均具有m 6A修饰位点，有些细胞或者组织内的m 6A水平较高，但有些可能m 6A修饰水平却很低；

2. 我们推荐的抗体虽然是目前市面上品质较好的，但还是可能存在一些“漏网之鱼”，也就是部分m 6A修饰的RNA未能与抗体结合。

3. 此外，还可能存在提取出来的RNA量不够下游的反转录以及后续的m 6A-IP-qPCR，这个可能是由于RNA富集效果不好，因此需要回溯免疫磁珠与m 6A抗体结合的操作过程是否正常；另外一方面也有可能是由于m6A修饰的RNA整体偏低，建议加大整体的反应体系。

• 第六步，cDNA的合成：

按照反转录试剂盒进行cDNA的合成，（注意：由于该处的打断后的RNA不一定带有polyA尾，所以在这里，进行反转录试剂盒挑选时，建议选择为随机引物并非polydT的反转录试剂盒）

• 第七步，m 6 A-IP-Qpcr：

根据m 6A-seq的结果，对具有m 6A修饰的基因设计适合引物，并采用试剂盒进行qPCR定量实验（在这里，我们推荐老师采用相同浓度的IP和Input进行qPCR，避免繁重的计算）。

qPCR的实验结果为CT值，在这里，大家可能会得到四组Ct值，分别为：对照input的Ct，对照IP的Ct，处理组input的Ct值和对照IP的Ct值，通过以下方式便可计算出这段Peak的变化趋势了：

ΔCt=Ct IP-Ct Input

ΔΔCt=ΔCt 处理组-ΔCt 对照组

Fold Change（相对表达量）=2 （-ΔΔCt）

一般来说，我们认为当Ct值小于35时，该值是可信的。这里推荐不太建议把CT值在28-30以上的基因作为后期验证的候选基因。当Ct值过大时，可能存在qPCR的假阳性，当这种情况出现时，考虑以下原因：

①RNA质量不好，导致qPCR失败，建议重新IP；

②也有可能该基因m 6A修饰程度并不高，导致被拉下的片段偏少，进一步造成Ct值偏大，建议重新挑选目的基因；

③也有可能引物设计不够好，导致循环数偏大，建议看看融解曲线是否有特异性峰。如果没有考虑重新设计引物。

作者简介：

何炳楠博士，联川生物运营部生物信息工程师，负责m 6A、RIP、ChIP、转录组、10X单细胞等项目的生信分析及售后工作，在博士期间接受了严格的学术训练，具备扎实的生化功底。何博知识渊博，语言风趣自然，能够博采众长并且用一种较为轻松的方式解答客户的各种疑惑，已展现出联川新一代网红的王者之气。

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