想知道特定物种能否开展测序?首先你得会基因组查找和评估

特定的物种能否开展测序项目,需要对该物种的基因组信息进行评估。通常完整的基因组注释信息文件应该包括:

① fasta/fa格式,即基因组序列信息,里面通常以>chr1表示染色体信息,ACGT等表示染色体下具体的基因组信息。

② gff/gtf文件,即基因组中特征文件信息。这是一种文本文件,里面具体某个基因在基因组上是正义链(+)还是反义链(-),什么位置到什么位置属于外显子等都在这个文件内。后面评估该物种是否符合分析,这个文件非常重要。

③ gene annotation,即基因备注or注释信息。这边特指某些基因一些注释信息,如钙离子转运蛋白、磷酸化转移酶等相应基因功能注释都在这个文件中。这种文件为可选,并不是必须的。

所以接下来,我们在这里介绍几种基因组查找的方法。需要注意的是,目前主流查找基因组的方法里面,基因组注释信息储存最多的是美国的NCBI,其次为欧洲生物信息学中心的ensembl,旗下包括ensmebl(主要为一些模式动物)、ensembl plants以及ensembl Metazoa。另外美国能源部JGI以及各个课题组自己构建的基因组数据库上也能下载到fasta和gtf文件。

这些fasta文件和gtf文件,Windows运行环境下只要不是太大,都是可以使用一款名为Notepad++文本软件打开的。这边不建议打开超过300MB大小的文件,如果太大的话可以现在Linux环境中使用head命令或者cut shell指令切割几千行输出一个较小的文本文件来进行查看。

这边模式物种和常见物种如人、小鼠、线虫等建议使用Ensembl数据库,水稻、番茄建议使用Ensembl Plants数据库,昆虫或其他物种可以前往Ensembl Metazoa或NCBI下载。部分植物和真菌在美国能源部JGI数据库也有存储。

我们先以Ensembl为例进行介绍,另外NCBI以及JGI也大同小异。

第一步如上图所示,打开https://www.ensembl.org/index.html ,点击View full list of all species后我们选择Duck。

第二步按照红色框框处,点击超链接后,会进入到一个ftp界面。

这边特别需要gtf文件或gff文件。ensembl往往在FTP中有好几个gtf文件,我们选择chr.gtf.gz结尾的即可,我们不需要在gtf里面添加其他信息,只需要染色体上的基因注释信息即可。

第三步,基因组组装信息评估。

下一步就需要对基因组进行一些数据上的评估,我们继续回到刚才的界面,按照上图所示点击More information and statistics后出现了一些统计信息,我们大致有一个标准(不是绝对)参考如下:

① 序列一致性评估

基因组是通过reads组装得到,这一步,是将reads比到基因组上,验证reads对基因组的覆盖情况,用于评估组装的完整性以及测序的均匀性。较高的mapping rate(90%以上)以及coverage(95%以上)认为组装结果和reads有比较好的一致性。

② 序列完整性评估

所谓完整性评估,即评估组装得到的基因组对基因区的覆盖程度,一般需要借助RNA方面的证据进行评估,如EST数据或RNA reads。由于用来评估的RNA方面证据不同,得到的比例也会有差别。一般来说,50%的scaffold覆盖基因的95%以上,85%的scaffold覆盖基因的90%以上,认为组装较完整。

③ 准确性评估

通过全长BAC序列,可以通过与组装结果的比对,对组装结果的正确性进行验证,从BAC序列和scaffold是否具有较好的一致性来判断组装质量。

④ 保守性基因评估

即根据广泛存在于大量真核生物中的保守蛋白家族集合(248个core gene库),对组装得到基因组进行评估,评估组装基因组中的core gene的准确性和完整性。可以通过该物种和同源物种cegma的比例,判断保守基因组装情况。

第四步就是评估gtf或gff文件。

如果exon cds等信息没有出现,甚至出现大片段大片段的region,这种基因组注释文件注定是没办法继续用于后续分析的。理想状态是部分基因的exon数量比cds多,这种意味着带有UTR。有些gtf中只有cds没有exon,勉强也能分析。只有exon和cds注释信息全部缺失才无法进入下游分析。

gtf文件,Windows条件下只要不是太大,都是可以使用一款名为Notepad++文本软件打开的。这边不建议打开超过300MB大小的文件,如果太大的话可以现在Linux环境中使用head命令或者cut shell指令切割几千行输出一个较小的文本文件来进行查看。

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