羧甲淀粉钠的结构和吸水膨胀性的相关性分析

交联是指通过共价键连接直链或支链高分子，形成网状或立体的高分子结构[4]。交联作用使分子间通过化学键相连接，加强了分子间氢键作用力，增强了结构的强度，抑制颗粒发生膨胀、破裂以及对黏度的影响[5]。交联结构能够降低其水溶性，使产品在水中易于分散、溶胀，不会形成高黏凝胶屏障。交联度传统的测定方法有溶胀法、沉积法、黏度法、磷含量法等[6]，但这些物理化学方法均存在一定的局限性，不能准确地表示出淀粉的交联度。本文参考核磁共振法测定橡胶交联度的方法[7-10]，采用低场核磁共振成像技术测定CMS-Na的交联密度[11-13]。低场核磁共振成像技术在高分子聚合物领域具有广泛的应用。能够检测材料的弛豫时间和交联密度，主要检测的对象是结构中的氢核，由于聚合物中氢核所处化学环境不同，氢的核自旋存在差异，表现为弛豫行为的不同，弛豫时间的差异能够反映聚合物的分子动力学信息，而聚合物的分子动力学信息直接与聚合物的交联密度相关。交联密度描述了交联聚合物中交联键的多少，交联密度越大，表示单位体积聚合物内交联键数目越多，交联度也就越大。交联聚合物中存在3种链，包括交联链、悬尾链和自由链，各链的自由度依次增加，图1所示为高分子聚合物的内部交联示意图，链与链之间通过化学键链接的为交联链，相对自由度较小，运动性较差。一端悬垂的为悬尾链，自由度大于交联链，运动性比交联链好。在体系中独立存在，未受任何束缚的为自由链，自由度最高，运动性最好[14]。

通过弛豫时间(T2)能够反映各链的自由度大小。如果0.1~1ms处的T2信号源自交联链氢质子，则1~10ms左右的信号源自悬尾链氢质子。通过比较各链的弛豫时间，并借助分析模型得到产品的交联密度信息。

取代度(degree of substitution，DS)是指平均每个葡萄糖单元中醇羟基被羧甲基取代的数目[15]。醇羟基被羧甲基取代为醚键官能团，醚键官能团的取代数目越多，产品的取代度就越高。由于每个失水葡萄糖单元中只有3个羟基能被取代，所以取代度最高为3。低取代度的CMS-Na在加热条件下才能发生糊化，糊化温度随取代度升高而降低，当取代度在0.15左右时，产品即可在冷水中吸水膨胀。产品在水中的溶解度随取代度的增加而增加，取代度越高，产品在水中的溶解速度越快，高取代度的产品在冷水中即可溶解[5]。目前取代度多采用化学方法进行测量，常用的方法包括比色法、酸洗法、直接滴定法、铜盐沉淀法等。本研究采用酸洗法[16]测定CMS-Na的取代度，结构中-CH2COONa经盐酸反应后全部转化为-CH2COOH，-CH2COOH与已知过量的NaOH中和后，剩余的NaOH用HCl标准溶液滴定，根据消耗的滴定液计算取代度值。

本文通过核磁技术及化学方法分别测定来源于国内外不同厂家不同批次CMS-Na的交联密度、取代度和吸水膨胀性数据，力图找出这3组参数之间的相关性关系，探究交联密度和取代度对CMS-Na崩解性能的影响。对结构与性能之间相关性的理解对于处方开发具有重要意义，通过这种相关性能够解释结构和功能之间的复杂性，为处方优化提供依据。同时通过对交联密度、取代度和吸水膨胀性之间差异性的描述，在仿制药一致性评价过程中，能够充分理解相同的药用辅料能否相互替代的问题。

材料与方法

1 仪器

磁共振交联密度仪(苏州泰纽测试服务有限公司，型号: VTMR20-010-V-T); 核磁共振波谱仪(Bruker公司，型号: AVANCE NEO600MHz)。

2 试药和试剂

CMS-Na(A厂家4个批次，A1批号: 210427，A2批号: 210302，A3批号: 210801，A4批号: 210301; B厂家3个批次，B1批号: 20210526，B2批号: 20210511，B3批号: 20210916; C厂家，批号: 105M50W; D厂家，批号: RH300479; E厂家，批号: 41110201042; F厂家，批号: C12883235; G厂家2个批次，G1批号: H2121236，G2，批号: I2102035; H厂家，批号: C86933784; I厂家3个批次，I1批号: TF45220201，I2批号: TF45220401，I3批号: TF45211201); 2mol·L-1HCl溶液(国药集团化学试剂有限公司，批号: 20180427，规格: 500mL，纯度: 分析纯); 0.1mol·L-1 NaOH溶液(国药集团化学试剂有限公司，批号: 20180223，规格: 500g，纯度: 分析纯); 0.1mol·L-1HCl标准溶液(中国食品药品检定研究院，批号: 539907-220504); 酚酞指示剂(国药集团化学试剂有限公司，批号: 20210529，规格: 25g)。

3 吸水膨胀性测定

称取CMS-Na样品1.0g置于100mL具塞量筒底部均匀铺展，量取50mL水沿量筒壁缓慢加入，尽量避免冲起样品。放置过程中需敲打量筒外壁，排出样品中气泡，15min后记录样品吸水膨胀体积，如膨胀表面高低不平，计最高与最低点的平均值[17]。

4 取代度测定

精密称定CMS-Na样品0.5g，置于100mL烧杯中，加入2mol·L-1HCl溶液40mL，用电磁搅拌器搅拌3h。将溶液过滤后使用80%甲醇溶液洗涤。滤饼用0.1mol·L-1 NaOH溶液40mL溶解，微热条件下加热至溶液呈透明状，加入酚酞指示剂，立即用0.1mol·L-1标准HCl溶液反滴至红色刚褪去[18]。

m为样品质量; 162为脱水葡萄糖的单元(anhydroglucost unit，AGU)摩尔质量; 58为每个被羧基取代的AGU质量增加量。

5 交联密度测定

CMS-Na的1H NMR谱见图3。利用核磁共振仪测定，扫描次数: 64; 谱宽: 19.8368ppm; 发射频率偏移: 6.175ppm; 延迟时间: 5s; 探头温度: 298k; 预扫描延迟: 6.5μs; 脉冲: 10.09μs; 样品旋转频率: 0Hz。在后续实验中质子信号强度来源于1H-NMR所有信号峰的积分。这些质子信号源于CMS-Na分子的甲基、亚甲基和次甲基基团。

5.1 实验参数

序列名称: CPMG(Carr-Purcell-Meiboom-Gill); 射频信号频率主值SF(MHz): 22; 射频信号频率偏移量O1(Hz): 100673.89; 射频90°脉冲宽度P1(μs): 2.92; 射频180°脉冲宽度P2(μs): 5.68; 采样带宽SW(KHz): 100; 重复采样间隔时间(TW，ms): 1000; 射频延时(RFD，ms): 0.2; 模拟增益(RG1，db): 20; 数字增益(DRG1): 3，累加采样次数(NS): 4; DR: 1; 回波时间(TE，ms): 0.15; 回波个数(NECH): 1500，前置放大增益(PRG): 3。

5.2 实验原理

硬脉冲常被用于一维核磁信号分析，硬脉冲CPMG序列是在自旋回波脉冲序列基础上，多次施加180°脉冲，从而可以得到多个回波的脉冲序列，见图4。

质子横向弛豫可以通过Bi-exponential模型[14]式(3)来表示:

式中，Mt / M0为归一化后横向弛豫随时间的变化，M0为横向弛豫的最大值，Mt为t时间的横向弛豫值，A0为交联链所占信号比重，B0为悬尾链所占信号比重，t2为内部交联链和悬尾链信号的横向弛豫时间。

通过样品的核磁衰减图应用外推法即可得到 式( 4) :

式中，q为高于玻璃化转变温度(Tg)的二阶矩与刚性晶格二阶矩间的比率因子，即各向异性的参数，Mrl为远低于Tg的温度下刚性晶格的二阶矩。计算交联密度(Cd):

其中，ρ为样品密度，Tav2为化学与物理交联参数(μs)，f为网络交联参数; ξ为转换参数5，α为统计链段中旋转主键系数，C∞为质子间距及局部链段运动参数，Trl2为刚性极限值(μs)，Mu为平均分子质量(g·mol-1)，n为重复单元内的主链键数。

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结果

1 取代度、交联密度和吸水膨胀性测定结果

17个批次样品取代度和吸水膨胀性测定结果见表1，17个批次样品取代度和吸水膨胀性的相对标准偏差分别为14.20%和36.50%，ANOVA检验所得P值<0.05，结果表明不同厂家之间的取代度和吸水膨胀性存在显著差异，其中A，C，E厂家取代度数值较大，相应的A，C，E厂家的吸水膨胀性值也较大。

CPMG序列是一种由一系列的Hahn回波组成，常用来测量质子横向弛豫的脉冲序列[19]。CPMG序列能够更好地处理磁场的不均匀性问题，因此常应用于主磁场均匀性较差的低场核磁共振波谱仪。本实验利用CPMG回波序列对来源于不同厂家的17个批次样品进行了质子横向弛豫的测量。并利用公式进行曲线拟合，得到交联链、悬尾链和自由链的T2，交联链、悬尾链与自由链各自所占的比重，以及产品的交联密度值，见表2，17个批次样品交联密度的相对标准偏差为14.22%，ANOVA检验所得P值<0.05，说明不同厂家交联密度测定结果存在显著差异，其中A，C，E厂家交联密度数值较小，与取代度和吸水膨胀性数值变化趋势相反。由此可知不同厂家产品由于合成工艺不同，物理化学属性也存在较大差异，因此不同来源的产品质量差别也较为显著。

2 取代度、交联密度及吸水膨胀性相关性分析

运用皮尔逊相关分析[20-21]方法对交联密度、取代度和吸水膨胀性数据进行相关性分析，皮尔逊相关系数越接近于1说明相关性越强，且显著性水平P值应<0.05。表3是对3组变量进行皮尔逊相关性分析的统计学描述。由表4可见，交联密度与取代度呈显著负相关性，相关系数为-0.814; 交联密度与吸水膨胀性呈显著负相关性，相关系数为-0.854; 取代度和吸水膨胀性则呈现显著正相关关系，相关系数为0.823。结果表明，取代度和交联密度是影响该产品吸水膨胀性的重要化学属性，对产品崩解性能具有重要影响。

讨论

本研究收集了来源于不同厂家17个批次CMSNa产品，研究对产品崩解性能有重要影响的物理化学属性交联密度和取代度与其吸水膨胀性能的相关性。目前高分子药用辅料交联密度的测量方法多采用传统的物理化学方法或间接测定方法，这些方法大多准确性较差，测得的结果与真实值存在较大偏差。本实验借鉴核磁共振法测橡胶交联密度的方法模板，采用低场核磁共振成像技术测定药用辅料的交联密度，测得的结果批次间稳定性较好，准确度较高。

仿制药研发中药用辅料的选择和应用是保证仿制药与原研药质量一致性的核心所在。不同厂家的辅料能否相互替代及相同功能的不同辅料能否相互替代是一致性评价的关键。不同厂家CMS-Na交联密度、取代度和吸水膨胀性值的差异，提示在仿制药研发过程中应尽量选择来自相同厂家的产品，以保证药品质量的批间稳定性。物质的内部结构决定了其物理、化学和功能性质。高分子结构单元间的作用力及分子链间的交联结构，直接影响其聚集态结构，从而决定高分子材料的主要性能。CMS-Na的交联密度和取代度从结构上决定了其功能属性，取代结构的亲水性和交联结构的稳固性共同影响CMS-Na的吸水膨胀性，从而影响其崩解性能。本研究采用皮尔逊相关性分析考察三者之间的相关程度，皮尔逊相关性系数>0.8时，变量之间存在极强相关性。通过对交联密度、取代度与吸水膨胀性值之间的相关系数的考察，结果显示三者之间的相关系数均>0.8，且结果具有统计学意义，说明三者之间具有极显著相关性，表明交联密度和取代度对CMS-Na的崩解性至关重要，交联密度和取代度是影响CMS-Na崩解性能的关键质量属性。崩解剂中结构和性能的复杂关系能够为处方优化中崩解剂的筛选和应用提供理论参考。

参考文献

详见《中国新药杂志》 2023年 第32卷第22期

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