在基线时，DCB组和NDB组之间的细菌（物种水平）或真菌（OTU水平）的α多样性没有显著差异。DCB组的β多样性在DCB组中均显著高于NDB组的细菌（物种水平）和真菌（OTU水平）。DCB组和NDB组在细菌水平上的总体差异显著，而真菌水平的差异相对不显著。在细菌物种水平上，ICI处理后未观察到α多样性的显着变化。然而，在6-8周后，两组之间细菌β多样性（物种水平）的差异逐渐消失，表明免疫疗法对肠道细菌的分布有更大的影响。在真菌水平上，随着ICI的使用，α多样性总体呈下降趋势，然后逐渐恢复。DCB组和NDB组之间的差异在6-8周后出现，之后它们消失，β多样性相对稳定。

根据多组学数据，检测到894种细菌（基于物种）、1,906种真菌（基于OTU）和620种代谢物。比较DCB和NDB组在不同系统发育水平上的相对丰度，以研究肠道细菌和真菌组成与ICI处理之间的关系。在门水平上，DCB和NDB组的主要细菌（厚壁菌门和拟杆菌门）和真菌组成（k_Fungi、p_Ascomycota和k_Fungi、p_Basidiomycota）是一致的。在物种水平上，DCB组和NDB组中百分比最高的细菌分别为s_Escherichia_coli和s_Faecalibacterium_prausnitzii，两组中百分比最高的真菌为k_Fungi;s_Candida_albicans。免疫治疗后，DCB组和NDB组的细菌和真菌组成在门水平的动态点上相对稳定，而在物种水平上，细菌和真菌的组成和百分比在动态点上变化相对较大。

2.ICI 处理的HCC中肠道细菌、真菌和代谢物显著不同

作者在DCB组和NDB组中鉴定了25种富集细菌、18种富集真菌和37种富集代谢物（图1A，B）。作者观察到，某些在DCB组中富集的肠道细菌或真菌在NDB组中的检测频率较低，甚至无法检测到，例如s_Phascolarctobacterium_faecium，s_Candidatus_Avimonas_narfia和k_Fungi、g_Cladosporium。同样，在NDB组中检测到的某些肠道细菌或真菌在DCB组中检测到的频率较低，甚至无法检测到，例如s_Actinomyces_sp_ICM47，s_Senegalimassilia_anaerobia，s_Faecalibacillus_faecis和k_Fungi;g_Trichoderma（图1A）。大多数差异表达的代谢物在DCB组中富集（图1B）。此外，基于细菌的丰度构建了系统发育树，该树主要分布在DCB组的Candidatus_Saccharibacteria和NDB组的厚壁菌门（图1C)。基于真菌，系统发育树表明k_Fungi、p_Ascomycota分布在DCB组，k_Fungi、p_Basidiomycota分布在NDB组。PR、SD和PD等临床评估反应中细菌的分布差异存在差异，PD在门水平上以放线菌为主，在物种水平上以Actinomyces_sp_ICM47、Senegalimassilia_anaerobia和Faecalibacillus_faecis为主（图 1D）。

图1. 免疫检查点抑制剂治疗的肝细胞癌中肠道细菌、真菌和代谢物显着不同

为了深入了解多界分类群之间的潜在相互作用及其在HCC免疫治疗反应中的潜在作用，作者根据差异细菌种类、真菌和代谢物的丰度对多界共丰度网络分析进行了改变。一般来说，NDB组患者的生态网络（75个分类群和2,775个关联）比DCB组患者（69个分类单元和2,346个关联）更复杂。除了界内分类群之间的强相关性外，作者还发现DCB和NDB组的界间物种之间存在实质性的关联，尤其是细菌和代谢物之间的关联。在调整关联系数（r>0.4）后，作者发现DCB组的关联数量高于NDB组，这表明中等相关的分类群（如细菌和代谢物）可能在免疫有益人群中发挥更大的作用（图2)。特别是，在DCB组中发现了新兴的跨界间相互作用;例如，差异细菌种类如 s_Butyricimonas_virosa 和 s_Candidatus_Avimonas_narfia与代谢物如丁香醇、鞘氨醇和L-谷氨酰胺 （图2)。在DCB和NDB组中，与其他多界分类群高度相关的真菌数量较少，这表明真菌在整个免疫治疗中发挥着相对稳定的作用。

图2. DCB和NDB组患者多组学分类群之间的共丰度相关性

3.ICI 处理的 HCC 中的微生物功能改变

由于微生物群的个体间异质性很大，不同个体的不同菌株似乎可能使用共同的途径来触发类似的病理变化。因此，利用多组学功能注释来探索HCC免疫治疗中微生物的一些可能变异，并提供可能的研究策略。分析了9个KEGG通路、74个KEGG同源（KO）基因和18个宏基因组的亚环通路，以及LC-MS/MS的35个KEGG通路（基于相关性强度，其中15个与代谢通路密切相关）（图3A-C）。基于宏基因组测序的KEGG通路水平，两组间α多样性无差异;然而，DCB组的β多样性显著高于NDB组。使用ICI后，α多样性相对稳定，而整个β多样性先呈下降趋势，然后逐渐恢复。基于KEGG通路数据库和代谢物注释分析，KO00250（丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢）、KO00910（氮代谢）和KO00750（维生素B6代谢）是细菌和代谢物共同感兴趣的途径（图3B，C)。细菌（KO基因）和代谢物通过KO00250途径相互作用，调节HCC患者对免疫治疗的反应，这可能是微生物调节免疫机制的重要途径。

图3. 宏基因组和代谢组学分析的功能注释

4.多界间的相互关联以及与KEGG通路的相关性

为了进一步探究细菌、真菌和代谢物的生态关联，作者分析了25种细菌、18种真菌和37种代谢物之间的相互相关性，以及它们与9种KEGG途径的关联（图4)。总体而言，内部相关性明显大于相互相关性，细菌-代谢物关联的相互相关性更频繁，而真菌-代谢物和真菌-细菌关联相对较少。代谢物和真菌与KEGG的相关性相对较弱，而细菌与KEGG的相关性较强，并且与DCB组中表达或富集的代谢物大多呈正相关。整体多界微生物相关性表明，细菌与代谢物和KEGG通路的相关性更密切，而真菌的相关性相对较低，这表明细菌可能在HCC免疫治疗中发挥更大的作用，并通过多种代谢物影响KEGG通路。

图4. 细菌、真菌、代谢物和KEGG通路之间的多界相互相关性分析

5.预测模型以及肠道微生物组、微生物衍生代谢物与存活率之间的关联

为了研究预测响应状态的潜在生物标志物，作者开发了一个基于DCB和NDB组中细菌的LASSO回归模型。在训练集中，鉴定了18个关键微生物生物标志物，并构建了曲线下面积（AUC）值为100%（图5A）。它还可以预测测试集中的响应状态，AUC值为75.63%（图5A)。这些结果表明，18种细菌关联的模型是HCC患者是否会从免疫治疗中获得临床益处的良好预测和区分因素。

为了进一步探索与生存相关的微生物分类群和代谢物，作者根据DCB和NDB组中这些差异富集分类群的平均丰度，将训练集中的HCC患者分为高丰度组和低丰度组。富集s_Actinomyces_sp_ICM47的患者有显著更差的PFS和OS（图5B)。s_Senegalimassilia_anaerobia同样与较差的PFS和OS（图5B)有关联。在富集galanthaminone患者中观察到生存获益（图5B).根据细菌或代谢物是否同时有益于生存，将HCC患者进一步分为良好、中度和较差生存组。单因素和多因素分析结果表明，年龄（<60岁）、ECOG PS（1分）和最大肿瘤直径（≥5 cm）是危险因素，而s_Actinomyces_sp_ICM47或s_Senegalimassilia_anaerobia联合galanthaminone（良好组）是 HCC 患者 OS 的阳性因素。此外，细菌和代谢物存活率的联合分析显示，s_Actinomyces_sp_ICM47或s_Senegalimassilia_anaerobia的低表达联合使用galanthaminone预示着更好的存活率（图 5C，D)。作者的研究结果表明，肠道微生物中特定分类群或代谢物的富集可能会增强对抗PD-1治疗的临床反应并延长生存期，从而预测接受免疫治疗的HCC患者的生存获益。细菌和代谢物的结合预测了更高的生存率，这表明这些高度富集的细菌或代谢物的共同存在可能通过某种机制增强免疫治疗对患者的影响。

图5. 预测模型以及肠道微生物组、微生物衍生代谢物与生存之间的关联

6.肠道细菌、真菌和代谢物受临床因素的影响

肠道微生物学，包括细菌、真菌和代谢物，是一个复杂的、动态平衡的系统，受多种因素的影响。为了阐明临床表型对肠道微生物的可能影响，作者进行了差异细菌、真菌、代谢物和KEGG通路与临床表型的相关性分析，并利用CCA分析探讨了临床表型对细菌和代谢物分布的影响。关联分析表明，差异表达的细菌（如s_Clostridium_scindens和s_Clostridia_bacterium_UC5_1_1D1）与总胆红素（Tbil）和BA等临床表型密切相关。相比之下，预测与生存相关的细菌，如s_Actinomyces_sp_ICM47和s_Senegalimassilia_anaerobia，受临床因素的影响较小（图6)。肿瘤数量和肝内转移（IHM）与差异代谢物密切相关，而生存相关代谢物galanthaminone不受临床因素的影响 （图6)。大多数差异真菌和KEGG通路受临床表型的影响较小，而KO00250通路与临床表型没有显著相关性，揭示了真菌的相对稳定性以及KO00250通路在整个免疫治疗过程中所起作用的重要性（图6)。

图6. 肠道细菌、真菌、代谢物和KEGG通路与临床因素的相关性

CCA分析结果表明，临床表型对细菌分布的总体影响不显著，而对DCB组和NDB组代谢物总体分布的影响相对显著（图7A，B，D，E)。多种肿瘤相关因素，如天冬氨酸转氨酶、γ-谷氨酰转移酶（GGT）、丙氨酸转氨酶、大小和血管浸润，显著影响肠道细菌（如s_Candidatus_Avimonas_narfia）的分布，而GGT、碳水化合物抗原19-9、IHM、肿瘤数和TBil显著影响代谢物的分布，如galanthaminone和sphingosine（图7B，C，E，F)。临床因素对DCB组和NDB组肠道微生物富集异质性的影响表明，ICI治疗的临床反应和生存获益取决于整个肠道微生物的多样性和差异富集的分类群落。

图7. 肠道微生物组和微生物来源代谢物的分布受临床因素的影响

结论

在这项研究中，首次通过多组学测序描述了多界微生物群（包括肠道细菌、真菌及其代谢物）在接受ICI治疗的HCC患者中的状态和特征。作者的研究结果证明了细菌分类群作为ICI临床疗效的预测生物标志物的潜力，以及细菌及其代谢物作为预后生物标志物的潜力。

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