项目背景

研究人体肠道微生物组成及其与健康和疾病的关系被认为是21世纪的主要挑战之一。以高通量测序为主的分子技术因其具有快速、高通量等优势，被广泛应用。

然而，仅依靠分子手段，无法全面反映研究对象真实的微生物群落结构。随着培养组学技术的出现，纯培养法重新进入全球科学家视野。大规模地分离培养肠道微生物，获取大量不同物种，以培养的结果互补测序的结果，成为了全面真实研究人体肠道微生物区系不可或缺的重要一环。

项目需求

健康人体来源粪便样品10个（对照组），某疾病患者来源粪便样品10个（实验组）。

期望非定向分离两组样品中不同物种的细菌，每组样品各100个物种，以调查和对比两组人群的肠道微生物组成，同时储备菌种资源以备后续研究及开发。

传统方案

实验方案：以LB、GAM、MRS三种培养基，同时设好氧、厌氧条件（厌氧产气袋），37℃培养。

周期和成本：6个月，总计进行约10批次实验，纯化和鉴定菌株数量约2万株。人力投入5人，菌株鉴定费用（16S一代测序）约20万元，其他材料成本约3万元。

实验结果：两组样品分别分离得到36、30个物种，物种数量较少，数据较单薄，不足以支撑研究两组人群肠道微生物组成的差异，未达到实验目的。

此方案的缺点及原因分析：

①经费投入和结果产出不成正比，仅获36、30个物种，未达实验目的。

②耗时耗力，消耗6个月时间，导致项目结题所剩时间紧张。

原因：

① 肠道细菌多为厌氧细菌，然而本方案采用的厌氧产气袋在细菌培养生长时不能产生足够低的环境氧浓度，且样品处理、培养基配置等过程均无法在厌氧条件下进行，故多数厌氧菌无法生长。

② 粪便样品中不同细菌细胞浓度具有差异，且不同细菌的最适生长条件也有差异，故涂布后细胞浓度高、生长所需条件简单的优势细菌更易生长，导致虽然挑取了约2万株菌，但绝大部分都是相同物种。

高通量细菌分离培养方案

实验方案：重新采集新鲜样品，以培养组学为技术基础，采用多种培养基组合，设置好氧、厌氧培养条件，以使不同细菌得以生长。厌氧条件下，从样品处理到菌株保藏全流程均在＜1ppm 氧浓度下进行，确保全程严格厌氧。挑菌前对菌落进行形态图像识别聚类和/或拉曼光谱特征峰聚类，以去除绝大部分重复菌株，随后利用机械臂代替人工高通量挑菌，并采用MALDI-TOF-MS高通量快速初步鉴定，以再次排除重复菌株，最终待选菌株被挑取进入16S测序终鉴定。

图1. 高通量细菌分离培养服务实验流程图