2.抗生素暴露对肠道分子生态网络（MENs）的影响

基于对数转换后的扩增子序列变体（ASV）丰度的皮尔逊相关性，采用基于随机矩阵理论的方法构建了28个时间序列MENs（图2），为网络构建提供了阈值。这些经验MENs与随机MENs存在显著差异，并具有无标度特性（R2=0.515–0.946）。在前几个月中，头孢曲松组的MENs明显比对照组简单，这表明抗生素暴露降低了肠道微生物群的网络复杂性。然而，随着时间的推移，网络复杂性呈现出恢复趋势并伴有波动。

图2. MENs的可视化

通过时间回归分析发现，抗生素暴露显著影响肠道微生物网络复杂性。抗生素组网络大小和连通性随时间增加，而对照组变化不明显。抗生素组节点数初时减少后增加，接近对照组水平，但连通性初期较高后下降。平均聚类系数初期高于对照组，但随后下降。

图3. 网络参数可视化

节点间的正相关代表合作，负相关代表竞争。P/N比（正链接与负链接之比）反映肠道微生物间相互作用平衡，疾病网络P/N比高，健康网络负链接多。研究表明合作降低稳定性，竞争增加稳定性。本研究发现抗生素暴露初期增强肠道MENs正关联，降低网络稳定性，后逐渐恢复但仍有差异。

抗生素暴露导致肠道微生物网络模块性变化，初期模块数量减少，随时间逐渐恢复但不稳定，尤其在大模块和小模块数量上存在差异。抗生素还改变了模块内细菌组成及关联，尽管后期有所恢复。

由于不同微生物网络的大小和连通性差异，相对模块化（RM）在比较网络模块结构时更有价值。研究发现，抗生素组在初期RM较高，但随后与对照组在某些月份相似，而在其他月份差异明显。通过相关性分析，发现RM在两组中均随连接性增加而增加，但与节点数的关系在两组中相反。此外，RM在两组中RM均随着全局效率（GD）的降低而降低（图4）。总体上，头孢曲松组与对照组的RM与网络结构参数关系相似，但存在特定差异。

图4. 模块指数以及相对模块化（RM）和其他网络参数之间的相关性

网络复杂性变化影响物种角色，关键节点在塑造网络结构中起重要作用。研究发现，抗生素组中关键节点数量总体增加，但初期低于对照组，表明抗生素减少了关键物种数量。随时间推移，关键节点数量逐渐恢复，但在部分月份存在波动。两组间关键节点分类群差异显著，且抗生素组在恢复过程中出现了新的关键节点。这些差异可能是塑造不同微生物网络结构的关键因素。头孢曲松组网络脆弱性在多数月份高于对照组，尤其是初期和特定月份，但两组均随时间下降。稳健性在随机和靶向移除节点时，两组间存在显著差异，尤其在初期。抗生素暴露初期降低肠道MENs稳定性，后逐渐恢复但未完全达对照组水平。

总的来说，头孢曲松暴露初期显著改变肠道MENs，包括复杂性和稳定性。随时间推移，网络参数有所恢复但未达对照组水平，表明其负面影响持久。对照组中，微生物多样性和网络特性随时间波动，与年龄和动态变化相关。

3.肠道微生物生态网络（MEN）复杂性与稳定性的关系

为了确定抗生素胁迫下肠道微生物群落的MEN复杂性是否以及如何影响网络稳定性，作者对网络复杂性和稳定性的参数进行了相关性分析（图5）。结果表明：一方面，无论是否受到抗生素暴露的影响，肠道微生物群落中的网络复杂性与网络稳定性具有相关性。另一方面，由于两组之间MEN复杂性与稳定性之间的相关性以及复杂性和稳定性的度量存在显著差异，因此可以推断抗生素诱导的肠道MEN复杂性变化影响了网络稳定性。这些结果也支持了生态学理论，即复杂性产生稳定性。

图5. 网络复杂性与稳定性之间的相关性

4.抗生素暴露对肠道微生物代谢的影响

代谢组学分析揭示抗生素暴露显著改变了肠道微生物的代谢产物，尤其是氨基酸代谢受影响最大。这种影响在多个时间点持续存在，表明抗生素的后效应是长期的。此外，碳水化合物、脂质和核苷酸代谢等其他关键代谢途径也受到影响，这些变化可能对人类健康产生类似影响，增加代谢疾病的风险。这些结果表明：（1）头孢曲松暴露显著影响小鼠肠道微生物的代谢，如果观察到的结果适用于人类，则可能导致代谢性疾病的发生；（2）抗生素对某些肠道微生物代谢途径的后效应是长期的。

图6. 代谢组分析中差异显著的代谢途径

5.抗生素暴露后肠道微生物网络（MENs）与代谢组之间的关系

为了探讨肠道微生物网络（MENs）与代谢组之间的关系，本研究对头孢曲松组与对照组之间具有显著差异的代谢途径与各网络参数进行了相关性分析。结果表明，抗生素暴露引起的肠道微生物代谢途径变化（特别是与氨基酸代谢相关的途径）与MENs的变化有关，但二者之间的因果关系尚需进一步研究。

6.抗生素暴露对肠道微生物代谢功能的影响

本研究基于16S rRNA基因测序数据预测了肠道微生物的代谢功能，并进行了宏基因组学分析。结果表明，抗生素暴露显著影响肠道微生物代谢功能，首月影响最大，随后逐渐减弱但仍持续存在。对照组中抗生素生物合成等关键代谢途径优势明显，而抗生素组则受损严重，表明抗生素使微生物更加脆弱。这种代谢变化与微生物网络稳定性降低密切相关，抗生素暴露后网络稳定性显著下降，尽管后续有所恢复，但未能完全复原。此外，抗生素组抗生素生物合成途径的减少可能减少了竞争，进而降低了网络稳定性。这一变化趋势与网络稳定性的变化相吻合。

抗生素暴露显著影响肠道微生物，异生物降解与代谢途径在抗生素组多个时间点占据主导。表明抗生素处理可能促使部分细菌产生应激反应，增强了对有害因素的抵抗力。群体感应（QS）在抗生素暴露初期和长期后均显著增强，表明QS在应对抗生素应激和维持菌群稳定中起重要作用。抗生素的长期后效应导致微生物网络参数持续波动。综上所述，抗生素暴露不仅影响肠道微生物的代谢功能，还通过QS等通讯机制影响微生物群落的长期稳定性。头孢曲松暴露后，β-内酰胺类药物抗性显著增强，表明存在耐药性风险。同时，抗肿瘤药物抗性途径被削弱，可能因头孢曲松影响了特定微生物种群，进而影响其对抗肿瘤药物的耐药性。

图7. 根据宏基因组测序数据分析抗生素组和对照组代谢途径的丰度

7.抗生素作用引起的功能网络变化

基于16S rRNA基因测序数据，共构建了28个时间序列功能网络。通过比较两组每月聚类中排名前三的路径组成，发现大多数比较中两组聚类间共享路径数量较少，表明两组聚类在路径组成上的差异。两组大多数聚类包含的节点或链接数量不同，表明功能网络的拓扑结构存在差异。此外，基于第12个月样本的宏基因组测序数据，作者构建了功能网络。结果显示，抗生素组的功能网络聚类数少于对照组，抗生素组与对照组的功能网络拓扑结构存在显著差异。综上所述，头孢曲松治疗引起了功能网络的变化，包括网络拓扑结构、网络聚类数以及聚类路径组成的变化。头孢曲松对C57BL/6小鼠肠道微生物功能网络的影响具有长期性。

结论

本研究深入揭示了早期短暂抗生素暴露对小鼠肠道微生物多样性、微生物生态网络和代谢的长期影响。抗生素使用显著改变了小鼠的微生物多样性、代谢以及微生物生态网络的复杂性和稳定性。网络复杂性的变化影响了网络稳定性，而抗生素引起的肠道微生物代谢差异与微生物生态网络的变化密切相关。停药后，微生物多样性和生态网络虽有恢复趋势，但并未完全恢复到对照组水平，表明抗生素对肠道微生物多样性和生态网络的负面影响具有长期性。此外，抗生素治疗还对小鼠肠道微生物功能网络产生了长期影响。因此，如果小鼠研究结果适用于人类，应高度重视儿童短暂抗生素暴露的问题。

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