中山大学生命科学学院 (School of Life Sciences, Sun Yat-sen University, Guangzhou 510275, PR China)

摘要

核质大DNA病毒（NCLDVs；也称为巨型病毒）构成了核质病毒门（Nucleocytoviricota），能够感染多种真核生物，并且与宿主、原核生物及噬菌体交换遗传物质。研究发现一些NCLDVs能编码抗β-内酰胺、抗甲氧苄啶或抗吡啶膦酸的基因，表明它们可能是抗生素抗性基因（ARGs）在生物群落中传播的潜在载体。然而，NCLDVs中ARGs的发生率、其进化特征、传播潜力以及与毒力因子的关联尚未被探讨。在这项研究中，我们系统地调查了1416个NCLDV基因组，包括几乎所有目前可培养的分离株和来自全球不同栖息地的高质量宏基因组组装基因组。我们发现其中39.5%携带ARGs，这大约是噬菌体基因组的37倍。NCLDVs编码了12种ARG类型。最丰富的三种NCLDV编码ARGs的系统发育提示，NCLDVs不仅从真核生物，还从原核生物和噬菌体中获得ARGs。我们还证明，两种NCLDV编码的抗甲氧苄啶基因能够在大肠杆菌中赋予抗甲氧苄啶的能力。NCLDV基因组中ARGs的存在与移动遗传元素和毒力因子显著相关。

引言

抗生素抗性在2019年被世界卫生组织列为全球健康十大威胁之一。抗生素抗性可以通过点突变或水平基因转移（HGT）产生，其中后者通常被认为是驱动其快速传播的主要因素。水平基因转移主要有三种形式：接合、转导和转化。其中，转导，即噬菌体介导的遗传物质转移，是原核生物之间ARG交换的途径。在多种环境中已经检测到噬菌体中存在抗β-内酰胺抗生素、糖肽类、巨环内酯类、肽类抗生素和四环素的抗性基因。此外，有研究通过基于大肠杆菌的异源表达系统验证了水生环境中噬菌体编码的β-内酰胺抗性基因的功能。

原核生物不仅与其他原核生物和噬菌体交换遗传物质，还从真核生物中获取遗传物质。例如，有研究表明，一种赋予细菌抗粘菌素的基因可能来源于早期进化的真核生物。与原核生物类似，真核生物也会与其病毒交换遗传物质。一项对201种真核生物和108,842种病毒分类的水平基因转移的综合分析显示，NCLDVs可能感染所有主要真核微生物谱系，是真核生物多样性中遗传交换的主要贡献者。此外，有证据表明，许多在巨型病毒中发现的基因共享于原核生物或噬菌体。鉴于上述复杂的跨界水平基因转移，某些巨型病毒可能是真核生物与原核生物之间DNA转移的潜在有效载体。

迄今为止，仅有三项研究报道了NCLDVs中的抗生素抗性基因（ARGs）。在一项开创性研究中，Muller等发现六种属于Marseilleviridae科的NCLDVs分别携带编码二氢叶酸还原酶基因，其中一种二氢叶酸还原酶基因在酿酒酵母中表达时能够表达对甲氧苄啶和吡啶膦酸的抗性。Colson等在21个NCLDV基因组中记录了β-内酰胺酶基因的存在，并揭示了巨型Tupanvirus的β-内酰胺酶基因在大肠杆菌中表达后具有β-内酰胺水解活性。最近，在从永冻层宏基因组组装的八个NCLDV基因组中观察到了编码二氢叶酸还原酶或β-内酰胺酶的基因。这些先前的发现表明，NCLDVs是生物群落中抗生素抗性基因传播的潜在载体。然而，Nucleocytoviricota门中ARGs的发生率、其进化特征、传播潜力以及与毒力因子的关联尚未被探讨。

在本研究中，我们对1416个巨型病毒基因组中的ARGs进行了全面分析。这些基因组包括了几乎所有当前可获得的培养分离株基因组和来自全球不同栖息地的高质量宏基因组组装基因组。为了确保结果的可靠性，我们分别分析了分离株基因组和宏基因组组装基因组，以考虑可能的污染DNA序列的影响。我们还对超过40,277个噬菌体基因组的ARG谱进行了比较分析。构建了代表性NCLDV ARGs的基因树，以阐明它们与原核生物、真核生物和噬菌体中的同源基因的进化关系。我们在大肠杆菌中验证了两种选择的NCLDV编码ARGs的功能。此外，我们对NCLDVs的移动遗传元素（MGEs）进行了注释，以探索它们与ARG携带之间的可能关联。最后，我们对NCLDVs的毒力因子（VFs）进行了注释，并检查了它们与ARGs的共现模式。

结果与讨论

1.本研究使用的病毒基因组概况

图1. 病毒基因组及其抗生素抗性基因携带概况

本研究分析的NCLDV基因组包括130个分离株基因组和1,286个宏基因组组装基因组（图1A）。这些病毒基因组可以被分类为至少11个已知的NCLDV科。分离株基因组的前三大主要科是Poxviridae（占所有分离株基因组的32.3%）、Iridoviridae（10.0%）和Mimiviridae（8.46%）。MAGs的前三大主要科是Mimiviridae（6.61%）、Prasinoviridae（5.05%）和Pithoviridae（2.02%）。七个科（即Asfarviridae、Coccolithoviridae、Marseilleviridae、Mimiviridae、Phycodnaviridae、Pithoviridae和Prasinoviridae）在分离株基因组和MAGs中均有代表。

本研究分析的噬菌体基因组包括4,682个分离株基因组和35,595个宏基因组组装基因组（见图1D）。这些噬菌体基因组可以被分类为至少78个已知的噬菌体科。分离株基因组前三大主要科是Microviridae（20.4%）、Papillomaviridae（4.10%）和Autographiviridae（3.05%）。MAGs前三大主要科是Microviridae（12.8%）、Inoviridae（0.669%）和Autographiviridae（0.584%）。有25个科（包括Microviridae、Papillomaviridae、Autographiviridae、Retroviridae和Genomoviridae等）在分离株基因组和MAGs中均有代表。

2.ARG的病毒基因组的分类与栖息地分布

在NCLDVs中发现了总共749个类似抗生素抗性基因（ARG）的开放阅读框，而在噬菌体中发现了453个。在所研究的1,416个NCLDV基因组中，有39.5%含有类似ARG的开放阅读框。其中分离株基因组中，有63.8%，该比例是MAGs的1.7倍（见图1B）。不同分类的巨病毒携带ARG的可能性差异较大。如分离株前三大家族中，Poxviridae携带ARG频率为100%，Mimiviridae为81.8%，而Iridoviridae为15.4%。在MAGs中，Mimiviridae的ARG携带可能性最高（57.6%），Prasinoviridae的ARG携带可能性最低（0.00%）（图1B）。相比之下，噬菌体的ARG携带可能性明显较低（1.06%）。在已知的78个噬菌体家族中，只有4个携带ARG，而前三个主要的病毒家族都没有检测到ARG（图1E）。

NCLDV基因组中平均约有0.136%的ORFs被注释为ARGs（称为基因组的ARG携带潜力）。不同分类家族之间在ARG携带的基因组潜力上存在差异。在分离株中，Poxviridae的基因组携带ARG潜力显著高于Mimiviridae和Iridoviridae，分别为0.547%、0.113%和0.081%（Kruskal-Wallis test: n = 94, P = 8.1e-14,见图1C）。在MAGs中为Mimiviridae最高（0.162%），其次是Pithoviridae（0.053%）和Asfarviridae（0.034%）（Kruskal-Wallis test: n = 1,275, P = 1.6e-10,图1C）。相比之下，噬菌体的基因组ARG携带潜力明显较低（总体为0.008%），在前四大主要的噬菌体家族中，没有任何一个携带ARG（见图1F）。

图2 病毒基因组中抗药基因的多样性与组成

3.病毒基因组中ARG的多样性与组成

在NCLDVs中共识别出12种ARG类型，这些ARG类型包含19个抗菌耐药基因家族（定义参见CARD数据库）。平均而言，NCLDVs每个基因组中包含0.48种ARG类型。不同NCLDV家族在编码ARG类型的数量上存在显著差异，其中Phycodnaviridae（分离株平均为1.67）、Pithoviridae（1.40）、Pandoraviridae（1.29）和Mimiviridae（分离株平均为1.09，MAGs中为1.01）编码的ARG类型数量在所有已知NCLDV家族中最高（Kruskal-Wallis test: n = 97, P = 2.4e-5 for isolates; n = 1195, P = 1.4e-6 for MAGs, 见图2A）。

噬菌体总共编码了9种ARG类型，包括18个抗菌耐药基因家族。噬菌体每个基因组平均仅携带0.011种ARG类型（见图2B），这一数量远低于NCLDVs。就分离株而言，Straboviridae（0.52）和Herelleviridae（0.43）编码的ARG类型数量显著高于其他家族（Kruskal-Wallis test：n = 2,378，P = 3.0e-92，见图2B）。相比之下，没有已知的MAGs家族携带足够数量的ARG（>5个ARG）以便分析家族之间的潜在差异。

NCLDV分离株主要携带利福平（51.2%）和三甲氧苄氨（19.5%）耐药基因（图2C）。利福平耐药基因仅由Poxviridae携带。三甲氧苄氨是Pandoraviridae（85.7%）和Marseilleviridae（50.0%）的主要ARG类型。此外，Mimiviridae表现出明显的携带莫匹罗星耐药基因的趋势（88.9%）。其他家族，如Pithoviridae和Phycodnaviridae，主要携带大环内酯-林可酰胺-链霉素和肽类耐药基因。在MAGs中，ARG携带家族包括Mimiviridae和Pithoviridae，则都表现出多重耐药（分别为21.7%和50.0%）、大环内酯-林可酰胺-链霉素（分别为29.2%和12.5%）以及三甲氧苄氨（分别为10.5%和31.3%）耐药基因的高占比性（见图2C）。

在噬菌体中，三甲氧苄氨耐药基因被发现是最主要的ARG类型（分离株中占86.7%，MAGs中占68.6%），其次是大环内酯-林可酰胺-链霉素（分离株中占4.56%，MAGs中占12.0%）和多重耐药基因（分离株中占4.00%，MAGs中占7.46%）（图2D）。在由分离株代表的家族中，Straboviridae和Herelleviridae仅携带三甲氧苄氨耐药基因（图2D）。

主要的ARG抗药机制为抗生素靶标改变/保护/替代，在NCLDVs中占96.5%（图2E），在噬菌体中占97.5%（图2F）。在NCLDV的分离株中，Pithoviridae携带了相对较高比例（16.7%）的抗生素失活基因（图2E）。

在病毒基因组中，最常检测到的抗菌耐药基因家族是dfr基因，其在NCLDVs中出现303次，噬菌体中出现325次（表1）。dfr基因编码的二氢叶酸还原酶是三甲氧苄氨的靶点。细菌对三甲氧苄氨的耐药性可以通过dfr基因的突变、获取耐药同源基因或增加dfr基因数量来增加二氢叶酸还原酶的产生。其他主要基因家族包括F亚型ATP结合盒基因、ileS基因和糖肽抗性簇相关基因等（见表1）。F亚型ATP结合盒蛋白属于ATP结合盒超家族，但缺乏跨膜结构域。它们与核糖体相关，一些可以通过与核糖体结合并引起构象变化来赋予耐药性，从而导致药物在细菌中的释放。ileS基因编码异亮氨酰-tRNA合成酶，是抗生素莫匹罗星的靶点。细菌对莫匹罗星的耐药性可以通过ileS基因的突变或获取本身耐药的替代ileS同源基因来获得。本研究中检测到的糖肽抗性相关基因，如vanT和vanH，是多个万古霉素抗性操纵子上的常见单位，通过使肽聚糖前体重构为D-Ala-D-Lac，从而降低万古霉素的结合亲和力。此外，抗生素失活机制主要由链霉素vat乙酰转移酶基因组成，该基因家族催化乙酰基从乙酰辅酶A转移到链霉素A化合物的次级醇上，使维吉霉素失活。

4.代表性NCLDV抗性基因的进化特征

对NCLDVs中最多的前三个抗菌耐药基因家族（见表1）及其与真核生物、原核生物和噬菌体同源基因的进化关系进行了分析。对于最主要的基因家族（即编码二氢叶酸还原酶的dfr基因），NCLDV序列并未形成单系群，而是表现出多样的潜在起源（见图3A）。首先，常观察到某些NCLDV序列与噬菌体序列具有较近的系统发育关系，形成了多个独特的谱系。其次，一些NCLDV序列插入在真核生物谱系中。最后，噬菌体和原核生物在二氢叶酸还原酶上的进化关系较为复杂，一些NCLDV序列插入在噬菌体/原核生物谱系中。与细菌的二氢叶酸还原酶序列的多重比对显示NCLDVs的dfr基因在trimethoprim结合位点具有保守性。

图3 代表性NCLDV抗药基因的进化特征

在NCLDVs中，某些F亚型ATP结合盒（ABC-F）序列已被鉴定为vga型ABC-F、msr型ABC-F或sal型ABC-F，而其他通过HMMs注释的序列则无法明确归属到更具体的亚家族。因此，我们构建了一个包括广义ABC-F蛋白家族的基因树，并在树上标记了与抗生素耐药相关的亚家族（图3B）。分析结果显示，NCLDVs的ABC-F蛋白主要聚集成两个不同的组群。其中大多数NCLDV序列与噬菌体序列一起形成了一个单系群，与细菌的ABC-F蛋白中的部分抗生素耐药亚家族具有较近的进化关系。此外，一小部分NCLDV的ABC-F蛋白则分布在真核生物序列的谱系中。

在NCLDVs中，第三大最常检测到的抗菌耐药基因家族（即ileS基因）在噬菌体基因组中并不存在（见表1）。研究表明，莫匹罗星选择性地抑制某些细菌和古菌的ileS编码酶，同时对真核生物的相应酶没有影响，因此真核生物对莫匹罗星具有天然耐药性。此外，先前的文献提出某些细菌对莫匹罗星耐药的ileS基因可能源自真核生物。我们发现，敏感于莫匹罗星的细菌ileS基因主要集中在由细菌序列主导的谱系中（见图3C）。相比之下，对莫匹罗星耐药的细菌ileS基因与真核生物的ileS基因表现出更近的进化关系，而巨型病毒的ileS基因则处于耐药细菌ileS基因和真核生物ileS基因之间。这一位置指示NCLDVs可能在真核生物和耐药细菌ileS基因之间的传递中扮演了桥接角色。

我们进一步推断了NCLDVs、噬菌体、真核生物、细菌和古菌中上述三种抗菌耐药基因家族的Ka/Ks比率。所有不同基因的Ka/Ks比率均明显低于1，表明这些基因经历了负选择压力（见图3D-3F），但选择压力在不同分类群之间可能存在显著差异。NCLDVs中dfr基因的平均Ka/Ks比率（0.075）显著低于其他三组的比率（噬菌体为0.104，细菌为0.120，真核生物为0.146；Kruskal-Wallis检验：n = 1,683，P = 1.0e-18，见图3D）。这一结果表明NCLDVs中dfr基因在进化过程中趋向于功能保守性和稳定性，可能解释了其在NCLDVs中的高发生率。NCLDVs中另外两个基因的Ka/Ks比率也显著较低（ABC-F基因为0.050，ileS基因为0.018；见图3E-3F），表明它们对NCLDVs具有重要的生物学意义。

5.选择的NCLDV编码ARG的功能验证

由于dfr基因在NCLDV基因组中的广泛存在，我们随机选择了两个NCLDV dfr序列，将它们引入到对甲氧苄氨基甲酸敏感的大肠杆菌菌株中来验证其耐药功能。其中一个来自Asfarviridae科的分离株，另一个来自Pithoviridae科的MAG（见图4A）。Asfarviridae分离株基因组在dfr基因的上游和下游注释信息有限，主要涉及与DNA修饰、修复、代谢和转录相关的基因。从矿山尾矿中组装出的Pithoviridae MAG在其dfr基因周围的编码区域有更多注释（15个基因）。在dfr基因周围10 kb区域内发现了一些可能与传染病相关的基因（包括Rab-5C和泛素连接酶）、一个潜在与水平基因转移（HGT）相关的I类内含子内切酶基因，以及两个编码膜结构域蛋白的基因，这些蛋白参与膜转运。

预测这两种NCLDV编码的二氢叶酸还原酶具有相似的三级结构（见图4B和4C），并且与细菌同源蛋白共享保守的甲氧苄氨基甲酸结合位点。尽管它们与细菌同源蛋白的氨基酸序列相似性较低（分别为33.5%和36.3%），我们推测这些基因可能在细菌中发挥作用。我们将这两个dfr基因分别引入到E. coli 5α菌株中，测试发现这两个dfr基因均能将对甲氧苄氨基甲酸敏感的大肠杆菌菌株的最小抑菌浓度（MIC）从0.5 µg/mL提高到64 µg/mL（见图4D）。

图4. 两个NCLDV dfr序列的功能验证

6.病毒基因组中ARG与移动遗传元件的相互依赖性

我们还调查了Nucleocytoviricota门中的多种MGEs。96.0%的NCLDV基因组携带MGEs（见图5A）。87.7%的NCLDV基因组携带内切酶，其次是重组酶（69.1%）、分辨酶（45.8%）和插入序列/转座酶（24.6%）。

在NCLDV基因组中，ARGs与MGEs之间存在显著的相互依赖性（双侧卡方检验：n = 1,416, P = 2.6e−6，见图5B）。58%的MGE阳性NCLDV基因组中含有ARGs，这一比例高于MGE阴性基因组的26.8%。NCLDV的ARG携带潜力并未因其MGE携带状态而显著变化（双侧Wilcoxon秩和检验：MGE-基因组n = 56，MGE+基因组n = 1360，P = 0.52，见图5C）。共定位分析显示，37.1%的与ARGs共现的MGEs位于其对应ARGs的10 kb范围内（72.9%位于30 kb内，见图5D）。

噬菌体的MGE携带频次比NCLDV低（63.0%，见图5E），但其MGE的携带状态对ARG的影响比NCLDVs更为明显。一方面，3.28%的MGE阳性噬菌体基因组中携带ARGs，高于MGE阴性基因组的0.423%（双侧卡方检验：n = 40,277，P = 4.7e−22，见图5F）。另一方面，MGE阳性噬菌体基因组的ARGs占总ORFs的平均比例为0.009%，显著高于MGE阴性噬菌体基因组的0.005%（双侧Wilcoxon检验：MGE-基因组n = 14,910，MGE+基因组n = 25,367，P = 3.7e-22，见图5G）。

与NCLDVs相比，噬菌体中MGEs与ARGs之间的关联更为紧密，53.3%的与ARGs共现的噬菌体MGEs位于其对应ARGs的10 kb范围内（85.9%位于30 kb内，见图5H）。

图5. 病毒基因组中抗药基因与可移动遗传元素之间的相互依赖关系

7.病毒基因组中的致病因子

我们进一步研究了同时携带ARGs和致病因子（VFs）的NCLDV基因组。在研究的NCLDV基因组中，共注释了2487个类似VF的ORFs。68.0%的NCLDV基因组含VFs（见图6A）。相比于不携带VF的基因组，携VF的基因组中ARG携带的可能性更高（63.7% 对比 35.4%，双侧卡方检验：n = 1,416，P = 4.4e-4；见图6B）。同时携带VF和ARG的NCLDVs主要来自未知科（81.8%，见图6C）或Mimiviridae科（13.6%）。NCLDV的ARG携带潜力与其VF携带状态之间未显示出相关性（双侧Wilcoxon秩和检验：VF-基因组n = 453，VF+基因组n = 963，P = 0.12，见图6D）。

噬菌体的VF携带可能性相较NCLDVs明显较低（4.88%，见图6E）。然而，噬菌体中ARGs与VFs的相互依赖性更为明显，11.2%的VF阳性噬菌体基因组中携带ARGs，为VF阴性噬菌体基因组的13.5倍（双侧卡方检验：n = 40,277，P = 7.5e-110；见图6F）。此外，VF阳性噬菌体基因组的ARG携带潜力也显著高于VF阴性噬菌体基因组（双侧Wilcoxon秩和检验：VF-基因组n = 38,310，VF+基因组n = 1,967，P = 2.5e-110；见图6H）。同时携带VF和ARG的噬菌体主要来自未知科（97.5%，见图6G）。

图6. 病毒基因组中的毒力因子及其与抗药基因携带的关系

结论

综上，我们揭示了NCLDVs中ARGs的多样性和发生率远高于之前的认知。我们同时验证了一些NCLDV编码的ARGs在细菌中具有表达抗性表型的潜力，并与MGEs和VFs有紧密的关联。我们的研究结果突显了NCLDV编码的ARGs的功能及其相关潜在健康风险，值得给予更多关注。

参考文献

Xinzhu Yi, Jie-liang Liang, Ping Wen, Pu Jia, Shi-wei Feng, Yuan-yue Zhuang, Yu-qian Guo, Jing-li Lu, Sheng-ji Zhong, Bin Liao, Zhang Wang, Wen-Sheng Shu, and Jin-tian Li*. (2024), Giant viruses as reservoirs of antibiotic resistance genes. Nature Communications, doi: 10.1038/s41467-024-51936-z

第一作者简介

第一作者：易歆竹，华南师范大学生命科学学院副研究员，从事环境与人体微生物组研究，应用多组学技术与微生物学手段探究微生物抗生素耐药基因的环境过程与传播机制。以通讯或第一作者在 Nature Communications，Nature Medicine，Nature Microbiology，ISME Journal，Water Research 等期刊发表SCI论文20余篇，H index为16。主持国自然青年项目、面上项目、广东省自然面上项目等。

第一作者：梁洁良，华南师范大学副研究员，研究方向为土壤微生物在矿业废弃地生态修复中的作用及其机制。作为第一或通讯作者在Nature Communications、The ISME Journal、Global Change Biology、Microbiome、Biological Reviews等国际学术期刊上发表论文近20篇，参与编写Springer Protocols 经典丛书《Methods in Molecular Biology》和中国科学院大学研究生教材《土壤生物学》（高等教育出版社），先后主持了包括国家自然科学基金面上项目、青年基金在内的多个国家级、省部级项目。

通讯作者简介

通讯作者：李金天教授，国家优秀青年基金获得者（2016年），华南师范大学生命科学学院教授，博士生导师。主要从事修复生态学、微生物生态学研究。现任教育部全国生态环境职业教育教学指导委员会委员、中国生态学会污染生态专业委员会副主任。应邀担任Journal of Applied Ecology、Soil Ecology Letters等国内外知名学术期刊编委。迄今，以第一或通讯（含共同）作者身份在Nature Communications、Biological Reviews、The ISME Journal、Ecology Letters、Global Change Biology、Microbiome等国际知名学术期刊发表SCI论文40余篇；主持国家重点研发计划项目课题、国家自然科学基金、International Foundation for Science等科研项目10余项。作为第二完成人获得2019年度广东省科学技术进步奖一等奖。

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